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1、基因工程第二章基因克隆所需的工具酶第一页，讲稿共四十八页哦2022-9-6n天然DNA的来源n染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、线粒体和叶绿体DNAn天然DNA的提取n准备生物材料n裂解细胞n分离和抽提DNA第二节 天然DNA的制备第二页，讲稿共四十八页哦2022-9-6限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）n是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶一一 .限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限
2、制酶HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。第三节第三节 限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNADNA片断化片断化第三页，讲稿共四十八页哦2022-9-61.1.I I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdhsdR R；hsdhsdM M；hsdhsdS S（h host ost s specificity for pecificity for D DNA NA r rest
3、riction estriction m modification and odification and s specificitypecificity）位于染色体上，三个基）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要因构成一个复合体，限制酶需要ATPATP、MgMg2+2+、SAMSAM（腺苷甲硫氨酸）。腺苷甲硫氨酸）。2.2.IIII型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli.coli中这两种基因位于质中这两种基因位于质粒上。粒上。3.3.IIIIII型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsdhsd与与hsdhsd基因产物结合成一亚单位，
4、基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有IIII型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。异性，因而被广泛用于基因工程中。二、限制修饰系统的种类二、限制修饰系统的种类第四页，讲稿共四十八页哦2022-9-61.1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指狭义指IIII型限制酶。型限制酶。2.2.命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、分命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、分离顺序。离顺序。例如：例
5、如：HinHindd前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzaeH.influenzae，“”表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的第三个限制酶。EcoEcoRIRIEscherichia coliEscherichia coli RI RI HinHinddHaemophilusHaemophilus influensae influensae d d SacSacI(II)I(II)StreptomycesStreptomyces achromagenes achromagenes I()I()三三.限制性内切酶的定义
6、、命名限制性内切酶的定义、命名第五页，讲稿共四十八页哦2022-9-61.1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点 ）识别）识别-8-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸 MboMboI NGATCNI NGATCN；AvaAvaII GG(A/T)CC II GG(A/T)CC Bam Bam HI GGATCCHI GGATCC；PpuPpuMI PuGG(A/T)CCPy MI PuGG(A/T)CCPy Not Not I GCGGCCGC I GCGGCCGC；SfiSfiI GGCC N N N N N GGCCI GGCC N N N N N GGCC CCGG N CCGG N N
7、NN NN NN N CCGG CCGG Fok Fok I 5 I 5-()9-3)9-3 3 3-()13-5)13-5 外侧，产生外侧，产生-端突起端突起 ）富含）富含四限制酶的特点四限制酶的特点第六页，讲稿共四十八页哦2022-9-6）对称性）对称性双对称双对称 EcoEcoRI 5RI 5-G A A T T C-3-G A A T T C-3 3 3-C T T A A G-5-C T T A A G-5 ）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.2.末端种类末端种类
8、 ）-端突起，个数为或个核苷酸端突起，个数为或个核苷酸 Pst Pst I 5I 5-CTGCAG-3-CTGCAG-3 5 5-CTGCA G-3-CTGCA G-3 3 3-GACGTC-5-GACGTC-5 3 3-G ACGTC-5-G ACGTC-5 ）-端突起，个数为或个核苷酸端突起，个数为或个核苷酸 EcoEcoRI 5RI 5-GAATTC-3-GAATTC-3 5 5-GOH PAATTC-3-GOH PAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 3 3-CTTAAP HOG-5-CTTAAP HOG-5四限制酶的特点四限制酶的特点第七页，讲稿共四十八页哦20
9、22-9-6）平齐末端平齐末端 SmaSmaI 5I 5-CCCGGG-3-CCCGGG-3 5 5-CCC GGG-3-CCC GGG-3 3 3-GGGCCC-5-GGGCCC-5 3 3-GGG CCC-5-GGG CCC-5 ）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端 ）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokFokI I Fok Fok I 5 I 5-GGATG(-GGATG()9-3)9-3 5 5-GGATG(N)9-GGATG(N)9 3 3-CCTAC(-CCTAC()13-5)13-5 3 3-CCTAC(N)13-CCTAC(N)13 ）能识别简并顺序的，
10、如：）能识别简并顺序的，如：AvaAvaI I AvaAvaI 5I 5-CPyCGPuG-3-CPyCGPuG-3 CCCGGGCCCGGG;C TCGGG;CCCGAG;C TCGGG;CCCGAG;CTCGAGCTCGAG四限制酶的特点四限制酶的特点第八页，讲稿共四十八页哦2022-9-6 1.1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制限制 酶酶 2.2.特点：特点：1 1）识别相同顺序）识别相同顺序 2 2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnKpnI GI GGTACGTAC C C AspAsp718 G 718 G GTACGT
11、ACC C SstSstI CCI CCGCGC GG GG SacSacI CCI CCGCGC GG GG五五.异源同序酶（异源同序酶（isoschizomerisoschizomer，同，同裂酶）裂酶）第九页，讲稿共四十八页哦2022-9-66、限制性内切酶的星号活性n在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特异性可能发生变化，结果一种限制酶酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点，得到不同的酶切片断，这就是限制酶的星号活性（星号活性（star activitystar activity）nEcoR 1 GAATTC-AATT第十页，讲稿共四十八页哦2022-9-66、限制性内切酶的星号活性n引
12、起星号活性的可能因素引起星号活性的可能因素n甘油浓度过高n离子强度不合适n阳离子的变化n溶液中PH值的变化在基因工程操作中，应避免星号反应的出在基因工程操作中，应避免星号反应的出现现第十一页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、限制酶的使用方法n用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最基本的实验技术n最常用的消化条件：反应体积：20ul10 xBuffer：2ulDNA浓度：0.51.0ul第十二页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、限制酶的使用方法1、影响限制酶消化DNA的若干因素nDNA的纯度的影响nDNA浓度的影响n酶浓度的影响n酶反应条件的影响n双酶消化第十三页，讲稿共四十八页哦202
13、2-9-6影响限制酶消化DNA的若干因素nDNA的纯度的影响n限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不完全酶解（部分酶切）nRNA或其他DNA的污染影响小n蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止酶切反应n解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质第十四页，讲稿共四十八页哦2022-9-6影响限制酶消化DNA的若干因素nDNA的浓度的影响DNA浓度过高n带进更多的杂酶和杂质n如限制酶量不足，可能引起部分酶切n底物浓度过高，可能引起底物抑制第十五页，讲稿共四十八页哦2022-9-6影响限制酶消化DNA的若干因素n酶浓度的影响1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多
14、，带进的杂质愈多，有可能增加Dnase 1的危险酶切设计时，甘油浓度不要超过酶切设计时，甘油浓度不要超过5 5第十六页，讲稿共四十八页哦2022-9-6影响限制酶消化DNA的若干因素n酶反应条件的影响一般酶的反应条件一般酶的反应条件：温度：37 PH：7.2 时间：2小时DNA酶切反应（控制反应时间）完全消化完全消化部分消化部分消化第十七页，讲稿共四十八页哦2022-9-6影响限制酶消化DNA的若干因素n双酶消化n反应条件相同：反应条件相同：同时同时加到反应管，加到反应管，同时同时反应反应n对温度要求不同对温度要求不同：先低先低温消化，温消化，再高再高温消化温消化n对盐浓度要求不同对盐浓度要求
15、不同：先低先低盐酶消化，盐酶消化，再高再高盐盐酶消化酶消化第十八页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、限制酶的使用方法2、单一限制酶酶切位点的创立 利用甲基化酶的修饰作用改变酶的识别序列，创造新的识别位点消除反应消除反应：某一种限制酶存在两种识别序列，如将其中一个序列中的某个碱基甲基化，使其不能被限制酶识别，从而使另一序列成为单一酶切位点邻近反应邻近反应：与限制酶识别序列邻近的碱基有时作为某个甲基化酶的识别序列，而使其不再被限制酶所识别如BamH 1：GGATCCGGATCC GGATCCGGCCGG第十九页，讲稿共四十八页哦2022-9-6构建DNA的物理图谱nDNA物理图谱：标明限制性内
16、切酶在DNA分子上的限制位点数目、限制片段大小及其排列顺序的图谱。又称限制性图谱。n构建物理图谱的常用方法n部分消化法n双酶消化法第二十页，讲稿共四十八页哦2022-9-6构建DNA的物理图谱n构建物理图谱的常用方法n部分消化法基本原理：首先首先以某个酶对DNA进行完全消化完全消化，再进行部分消再进行部分消化化：部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相应部位的2个以上小片段之和。根据两类消化中片段大小的关系和交错重叠现象找出各片段的邻近位置，排出它们的顺序。第二十一页，讲稿共四十八页哦2022-9-6某限制酶在一线型DNA分子上有三个切点：n完全消化：A,B,C,Dn部分消化：BC,AD,A
17、BC,D,ACD,B,AC,A,C推测其物理图谱。提示：从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段，然后根据剩余片段，推测其物理图谱从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段剩余：BC,AD,ABC,ACD,AC推测其物理图谱为：BCAD第二十二页，讲稿共四十八页哦2022-9-6从细菌中分离了一个18.1Kb的线形DNA，用Ava完全消化得到8个片段，部分消化产生14个片段，求其物理图谱。完全消化片段：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2)从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段剩余：6.6，6.5，5.3
18、，4.2，3.8，3.5，0.7部分消化片段：6.6，6.5，5.3，4.6，4.2，4.0，3.8，3.5，3.3，2.5，1.0，0.7，0.5，0.2第二十三页，讲稿共四十八页哦2022-9-6构建DNA的物理图谱n构建物理图谱的常用方法n双酶消化法两个限制性内切酶先分别单独消化先分别单独消化DNADNA的基础上，然后再同时或先后消化此然后再同时或先后消化此DNADNA基本原理：单酶消化时的某些片段在双酶消化时可能仍然保留，另一些片断可能消失而出现新的片段，说明一个酶的切点 可能正好在另一个酶的片段之内。那么，新出现的2或3个片段的分子量之和必然等于那个消失的大片段：根据片段的大小找出消
19、失片段与新生片段的关系，通过它们的交错重叠现象确定各片段间的邻近位置，组建出此DNA的物理图谱。第二十四页，讲稿共四十八页哦2022-9-6用双酶消化法组建某线型DNA的物理图谱n用甲酶单独消化产生两个片段a ,bn用乙酶单独消化得到三个片段A,B,Cn用甲酶、乙酶混合消化得到四个片段：A,1,2,C试分析其相互关系。a bA B CA 1 2 C第二十五页，讲稿共四十八页哦2022-9-6从大肠杆菌分离到一个质粒DNA，用EcoRI，Hinc，HpaI，SmaI进行单一和双酶消化，组建它们的物理图谱 第二十六页，讲稿共四十八页哦2022-9-6 根据片段的大小，将每一对酶的结果分别清理，除去
20、在单酶和双酶消化时共同产生的片段，再按照分子量大小，找出新生小片段和一个消失大片段之间的关系 第二十七页，讲稿共四十八页哦2022-9-6第四节 其他工具酶一、一、E.coliE.coli DNA DNA聚合酶（聚合酶（DNA pol DNA pol）E.coliE.coli 的的DNADNA聚合酶系统聚合酶系统nPol I 参与DNA修复,具35和53外切酶活性npol II 同上 具35外切酶活性npol III 参与DNA复制,具35和53外切酶活性E.coliE.coli pol I pol I的特点的特点n具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片
21、段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)n聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6）1.外切酶活性 第二十八页，讲稿共四十八页哦2022-9-6一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）n5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+GGCTATCGGA第二十九页，讲稿共四十八页哦2022-9-6一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）n3-5外切酶活性 从游离的3OH末端降解dsDNA成为单核
22、甘酸，但是它解离掉的部分主要是未配对的ssDNA.(其对dsDNA的外切活性可被53多聚活性所抑制)5CCGTATCGGAOH DNApol 1 5CCG GGC Mg2+GGC第三十页，讲稿共四十八页哦2022-9-6一、E.coliE.coli DNA聚合酶（DNA pol）n5-3外切酶活性 从5末端降解dsDNA成为单核甘酸，5 GATAGCCT DNApol 1 5 TAGCCT 3 GGCTATCGGA Mg2+3 GGCTATCGGA 第三十一页，讲稿共四十八页哦2022-9-6nE.coli DNA pol 在基因工程中的作用n制备高比活的DNA探针（采用缺口平移技术）n用于分
23、子克隆nDNA序列分析第三十二页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）n5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 1 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+GGCTATCGGA第三十三页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）n3-5外切酶活性 作用底物主要是ssDNA.(其对dsDNA的外切活性由于受到聚合酶作用的阻碍大大降低)第三十四页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）n在基因工程中的作用n用同位素标记DNA片断的3末端 当
24、DNA经限制酶酶切产生5端伸出的末端时，可用Klenow酶催化，在3端标记上与5端伸出的碱基顺序互补的核甘酸，在此反应中应用的同位素必须是3232P-dNTPP-dNTP第三十五页，讲稿共四十八页哦2022-9-6C T T A A 5G32P-dATPC T T A A 5G A*A*Klenow酶酶C T T A A 5G32P-dATP32P-dTTPC T T A A 5G A*A*T*T*Klenow酶酶第三十六页，讲稿共四十八页哦2022-9-6二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）n在基因工程中的作用n用同位素标记DNA片断的3末端n用Klenow酶可将5端伸出的末端填平为平末
25、端n在反向转录合成 cDNA 的实验中，用Klenow酶合成双链 cDNA,n除去3端的单链末端 第三十七页，讲稿共四十八页哦2022-9-6三、T4 DNA 连接酶缺口缺口(gap)(gap)切口切口(nick)(nick)断口断口(cut(cut)3HOP53HOP5ds-DNAds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口第三十八页，讲稿共四十八页哦2022-9-6三、T4 DNA 连接酶1.1.特点：特点：只连接只连接ds-DNAds-DNA分子，要求分子，要求3 3-羟基和羟基和5 5-磷酸基磷酸基 2.2.用途：用途：1)相同或相容粘性末端的连接 2)平整末端的相连 DNA平端
26、来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多3.3.抑制剂：抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mMPO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM第三十九页，讲稿共四十八页哦2022-9-65-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3PAGCTTAOH3-TTCGAA-53-TTCGAPHOA-5HOATTCGAP 退火退火5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5或或 5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5T4D
27、NA连接酶连接酶5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5或或 5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5T4 DNAT4 DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应(两种插入方向两种插入方向)+第四十页，讲稿共四十八页哦2022-9-6四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)一种有效转录RNA成为DNA的酶，产物为cDNA,（互补DNA）由两种亚基组成，带有聚合酶活性和外切酶活性。n聚合酶作用以RNA和DNA 为模板，合成DNA mRNAcDNA，sscDNAdscDNA.第四十一页，讲稿共四十八页哦2022-9-6四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合
28、酶)n3外切核酸酶作用（RNase H）从DNA.RNA的杂交链中特异性地降解RNA链，进而保留新合成的DNA链n在基因工程中的作用n用mRNA为模板合成单链cDNA，或以单链cDNA合成双链cDNA（制备制备cDNAcDNA库的常用方法库的常用方法）3.制备各种分子杂交的探针，用于检测DNA或RNA第四十二页，讲稿共四十八页哦2022-9-6五、核酸酶S I（单链特异的核酸酶）n降解ssDNA或ssRNA形成5磷酸末端的单核甘酸或寡核甘酸片断。n在基因工程中的作用n证明基因内部的间隔顺序n在cDNA合成中切开cDNA双链的发夹n构建新的质粒使用注意事项使用注意事项 1)避免长时间反应，因最适
29、酸性pH将导致DNA断裂或降解 2)避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口)第四十三页，讲稿共四十八页哦2022-9-6六、甲基化酶一一.甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序 1.1.限制修饰系统限制修饰系统I I、IIII、IIIIII型中的甲基化酶型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNADNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5 5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6 6-甲基腺嘌呤：甲基腺嘌呤：在在DNADNA重组实验中，重组实验中，常用的甲基化酶属于常用的甲基化酶属于IIII型型，它与相应的限
30、制酶的识别顺序，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如如：M.EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同第四十四页，讲稿共四十八页哦2022-9-62.2.E Ecolicoli 的的damdam、dcmdcm甲基化酶甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。dam G mATC，dcm C mCA/TGG 3.哺乳动物的甲基化酶 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。第四十五页，
31、讲稿共四十八页哦2022-9-6二二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响 1.dcm 1.dcm 和和damdam甲基化酶对限制酶的影响甲基化酶对限制酶的影响 1 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠如：完全重叠 BclBclI Idam(GATC)dam(GATC)；ScrScrFIFIdcm(CCA/TGG)dcm(CCA/TGG)边界重叠边界重叠 ClaClaI-damI-dam；SauSau96I-dcm96I-dcm2 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠）不能抑制某些限制酶活性，不管两者
32、的识别顺序为何种重叠 如：如：dam-dam-BamBamHIHI，SauSau3AI3AI，BglBglIIII，PvuPvuI I；dcm-dcm-BstBstNINI第四十六页，讲稿共四十八页哦2022-9-62.2.I I型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响 ）抑制同种限制酶的活性）抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCCBamHI(G GATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(G AATTC)）抑制不同种限制酶的活性）抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠顺
33、序边界重叠如：如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途甲基化酶的用途 ）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ）在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNADNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切第四十七页，讲稿共四十八页哦2022-9-6M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE第四十八页，讲稿共四十八页哦