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1、基因工程制药工艺第一页，讲稿共二十二页哦第六章第六章 基因工程制药工艺基因工程制药工艺n6.1 基因工程制药微生物表达系统基因工程制药微生物表达系统n6.2 基因工程大肠杆菌的构建基因工程大肠杆菌的构建n6.3 基因工程菌的发酵培养与控制基因工程菌的发酵培养与控制第二页，讲稿共二十二页哦6.3 基因工程菌发酵培养与控制基因工程菌发酵培养与控制n6.3.1 培养基组成与控制培养基组成与控制n6.3.2 培养工艺与控制培养工艺与控制n6.3.3 产物诱导表达与终点控制产物诱导表达与终点控制第三页，讲稿共二十二页哦6.3.1 培养基组成与控制培养基组成与控制n营养与环境作用：碳源、氮源、无机盐和生营
2、养与环境作用：碳源、氮源、无机盐和生长因子长因子n工艺作用：消泡剂工艺作用：消泡剂n筛选与表达：选择剂，诱导物筛选与表达：选择剂，诱导物第四页，讲稿共二十二页哦1、碳源、碳源n大肠杆菌大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源。：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源。n酵母酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。n添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。生长具有一定的促进作用。n浓度稍高后就表现出底物抑制作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。n葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。葡萄糖优先利用
3、会造成培养基的酸化。第五页，讲稿共二十二页哦2、氮源、氮源n直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。硝态氮。几乎都能利用有机氮源。n不同工程菌对氮源利用能力差别很大，具有不同工程菌对氮源利用能力差别很大，具有很高的选择性。很高的选择性。n大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。n酵母：利用氨基酸为氮源。酵母：利用氨基酸为氮源。第六页，讲稿共二十二页哦3、无机盐、无机盐n磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态。铜、锌、
4、锰、钼等微量元素的盐离子形态。n基因工程菌生长提供必需的矿物质。基因工程菌生长提供必需的矿物质。第七页，讲稿共二十二页哦4、选择剂、选择剂n维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。n两类：两类：营养缺陷互补营养缺陷互补标记和标记和抗生素抗性抗生素抗性选择标记选择标记n发酵培养过程中质粒易丢失，使之成为宿主菌。为了保证发酵培养过程中质粒易丢失，使之成为宿主菌。为了保证质粒的稳定性，不丢失，根据质粒的标记基因，添加或缺质粒的稳定性，不丢失，根据质粒的标记基因，添加或缺陷选择剂。陷选择剂。第八页，讲稿共二十二页哦n基因工程大肠杆菌含有基因工程大肠杆菌含有抗
5、生素抗性基因抗生素抗性基因，抗，抗生素作为选择剂：卡那霉素、氨苄青霉素、生素作为选择剂：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等。氯霉素、博来霉素等。n基因工程酵母菌常用基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型氨基酸营养缺陷型，缺，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。第九页，讲稿共二十二页哦5、诱导物、诱导物n诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。产物。n诱导物成为产物表达
6、必不可少的。诱导物成为产物表达必不可少的。nlac启动子表达系统：启动子表达系统：IPTG诱导。诱导。n甲醇营养型酵母：加入甲醇营养型酵母：加入甲醇甲醇进行诱导。进行诱导。第十页，讲稿共二十二页哦6.3.2 培养工艺与控制培养工艺与控制n温度温度n溶解氧溶解氧npH第十一页，讲稿共二十二页哦1、温度对工程菌生长的影响、温度对工程菌生长的影响n符合三基点原则：最低，最适，最高。符合三基点原则：最低，最适，最高。n大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度10。n大肠杆菌生长最适温度大肠杆菌生长最适温度37，最高温度，最高温度45。n酿酒酵母生长最适温度酿酒酵母生长最适温度30，
7、最高温度，最高温度40。第十二页，讲稿共二十二页哦n生长与生产温度不一致。生长与生产温度不一致。n较高温度表达量大，易形成包涵体。较高温度表达量大，易形成包涵体。n策略：策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。n对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。n策略：生产期可采用策略：生产期可采用先高温先高温，然，然后低温后低温，变，变温表达，避免蛋白质降解。温表达，避免蛋白质降解。第十三页，讲稿共二十二页哦两端变温发酵培养：两端变温发酵培养：n前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度。度。n后期：
8、较低温度发酵，对菌体合成目标产物后期：较低温度发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统：温度诱导型大肠杆菌表达系统：n生长期维持生长期维持37，生产期提高温度，生产期提高温度42。第十四页，讲稿共二十二页哦2、pH值对发酵的影响值对发酵的影响n细菌喜欢细菌喜欢偏碱性偏碱性：大肠杆菌适宜：大肠杆菌适宜pH为为6.5-7.5n真菌喜欢真菌喜欢微酸性微酸性：酵母适宜：酵母适宜pH为为5.0-6.0npH值影响产物稳定性，最适生长和最
9、适生产值影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。不同。n干扰素干扰素是在是在酸性酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。n乙酸乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。第十五页，讲稿共二十二页哦n了解发酵过程中各个阶段的适宜了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，以后，进一步设法控制进一步设法控制pH在合适的范围内。在合适的范围内。n分阶段控制分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长：根据试验结果来确定生长最适最适pH和产物最适和产物最适pH，以达到
10、最佳生产。，以达到最佳生产。第十六页，讲稿共二十二页哦3、溶解氧、溶解氧n工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。无氧呼吸会导致大量的能量消耗，同时产无氧呼吸会导致大量的能量消耗，同时产生有机酸，对细胞生长极为不利，甚至有生有机酸，对细胞生长极为不利，甚至有毒害。毒害。n从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。上。n调节搅拌转速和通气量。调节搅拌转速和通气量。第十七页，
11、讲稿共二十二页哦6.3.3 产物诱导与终点控制产物诱导与终点控制n一般情况下，目标产物对宿主是不利的一般情况下，目标产物对宿主是不利的n常用策略：诱导表达常用策略：诱导表达n根据启动子类型和目标产物表达的调控模式根据启动子类型和目标产物表达的调控模式而定而定n当产率最大时，结束发酵。当产率最大时，结束发酵。第十八页，讲稿共二十二页哦在生产中应严格控制在生产中应严格控制n适宜的诱导时间：非常重要适宜的诱导时间：非常重要n诱导物的浓度及其发酵温度，影响表达量，诱导物的浓度及其发酵温度，影响表达量，产物存在形式。产物存在形式。第十九页，讲稿共二十二页哦工程菌工程菌启动子启动子表达特点表达特点诱导条件
12、诱导条件大肠杆菌大肠杆菌lac高度严谨控制蛋白的转录与表达高度严谨控制蛋白的转录与表达IPTG大肠杆菌大肠杆菌T7高度严谨控制无毒蛋白的高水平表达高度严谨控制无毒蛋白的高水平表达IPTG大肠杆菌大肠杆菌PL、PR高度严谨转录控制有毒蛋白的表达高度严谨转录控制有毒蛋白的表达高温高温（42）大肠杆菌大肠杆菌phoA与信号肽序列融合，组成性分泌表达与信号肽序列融合，组成性分泌表达无需诱导无需诱导酿酒酵母酿酒酵母GAL高拷贝附加质粒，严谨控制，分泌系高拷贝附加质粒，严谨控制，分泌系统统半乳糖半乳糖毕赤酵母毕赤酵母AOX1整合到染色体中，严谨控制，分泌表整合到染色体中，严谨控制，分泌表达达甲醇甲醇毕赤酵母毕赤酵母GAP组成性分泌表达组成性分泌表达无需诱导无需诱导第二十页，讲稿共二十二页哦1、化学诱导表达、化学诱导表达n化学诱导型启动子：化学诱导型启动子：lac、tac、T7等等n诱导时间：对数生长期诱导时间：对数生长期n细菌：细菌：IPTG诱导诱导n甲基营养型酵母：甲醇诱导甲基营养型酵母：甲醇诱导第二十一页，讲稿共二十二页哦2、温度诱导表达、温度诱导表达n温度诱导型启动子：温度诱导型启动子：PL、PRn两段培养发酵两段培养发酵n诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。升高温度，合成产物。第二十二页，讲稿共二十二页哦