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1、关于基因工程制药(4)第一页，讲稿共四十五页哦v菌体的生长通常用比生长速率来表示。菌体的生长通常用比生长速率来表示。v工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长。v控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。高外源蛋白产率有重要意义。第二页，讲稿共四十五页哦 大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。度反映
2、了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢菌体的能量代谢和和小分子前体的供应小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。影响生物大分子的合成和菌体的生长。第三页，讲稿共四十五页哦一、菌体的生长与能量的关系一、菌体的生长与能量的关系p碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质是组成培养基的主要成分。p碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响值下降，从而影响菌体的生长。菌体的
3、生长。p提高提高pH，可减少乙酸的抑制作用，可减少乙酸的抑制作用第四页，讲稿共四十五页哦p分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。抑制作用。p 加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。第五页，讲稿共四十五页哦p大肠杆菌中克隆大肠杆菌中克隆携带氧能力的携带氧能力的VHB蛋白蛋白的基因可提高菌体生长速的基因可提高菌体生长速率。率。p采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，
4、阻止乙酸产生，可提高产采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。量。第六页，讲稿共四十五页哦二、菌体生长与前体供应的关系二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。致工程菌生长速率降低。第七页，讲稿共四十五页哦质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（5656拷贝）的工
5、程菌拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。馈调节。如：三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。如：三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。高拷贝质粒的工程菌（高拷贝质粒的工程菌（240240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应严紧反应”有关。有关。第八页，讲稿共四十五页哦p“严紧反应严紧反应”是当氨酰是当氨酰tRNAtRNA不足时不足时,核糖体在密码子上停留核
6、糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的并合成被称为魔点的ppGppppGpp的结果。的结果。pppGppppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响是一个重要的调控分子。它通过影响RNARNA链的延伸过程减少转链的延伸过程减少转录。录。第九页，讲稿共四十五页哦p它的浓度增加会导致在合成它的浓度增加会导致在合成mRNAmRNA和和rRNArRNA时时RNARNA聚合酶在模板上的移聚合酶在模板上的移动产生停顿，动产生停顿，RNARNA链延长速度减慢，使游离的链延长速度减慢，使游离的RNARNA聚合酶浓度降低，严聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如紧控制的启动子如rrnArrnA等的转录减少。等的转录减
7、少。p也可能也可能ppGppppGpp是通过干扰是通过干扰RNARNA聚合酶与聚合酶与PLPL启动子专一识别反应。启动子专一识别反应。影响影响核糖体浓度（降低）核糖体浓度（降低）第十页，讲稿共四十五页哦第六节第六节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代基因工程菌在传代（2525代以上）代以上）过程中常出现质粒不稳定的现象。过程中常出现质粒不稳定的现象。p分裂不稳定：分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。p结构不稳定：结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌指外源基因从质粒上丢失或碱基重
8、排、缺失所致工程菌性能的改变性能的改变第十一页，讲稿共四十五页哦一、质粒不稳定产生的原因一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素：常见分裂不稳定的两个因素：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）；（质粒丢失率）；这两种菌（这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。）比生长速率差异的大小。第十二页，讲稿共四十五页哦质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品不含抗性标记抗生素平不含抗性标记抗生素平板培养基板培养基10-12h100100个菌落个菌落含抗性标记抗生素平板培含抗性标记抗生素平板培养基养基 10-12
9、h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次,计算比值计算比值 (稳定性稳定性stability)第十三页，讲稿共四十五页哦二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法v1.合适的宿主：合适的宿主：宿主菌宿主菌v2.合适的载体合适的载体:质粒拷贝数质粒拷贝数v3.选择压力：选择压力：抗生素抗生素v4.分阶段控制培养：分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；先使菌体生长至一定密度；v 再诱导外源基因的表达再诱导外源基因的表达 v5.控制培养条件：控制培养条件：温度、温度、pH值、培养基组分、溶氧值、培养基组分、溶氧v6.固定化：固定化：卡拉胶卡拉胶第十四页，讲稿共四十五页哦 2.合适的载体
10、合适的载体低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，如果增加工程低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，如果增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。不利。第十五页，讲稿共四十五页哦 菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有影响。高生长速率时质粒拷贝数下降，但质粒稳定性增加。生长速率生长速率/h/h0.20.4质粒拷贝数质粒拷贝数10.510950400-半乳糖苷酶工程菌的连续培养半乳糖苷酶工程菌的连续培养3第十六页，讲稿共四十五页哦3.选择压力：选择压力：在培养基中
11、加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长，提高质在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。粒稳定性。4.分阶段控制培养：分阶段控制培养：由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。5.控制培养条件：控制培养条件：调控环境参数如温度、调控环境参数如温度、pHpH、培养基组分和溶解氧浓度、培养基组分和溶解氧浓度第十七页，讲稿共四十五页哦p含质粒的基因重组菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反含质粒的基因重组菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两
12、种菌比生长速率，可应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。改善质粒稳定性。p通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。第十八页，讲稿共四十五页哦第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试 基因工程菌的培养过程包括基因工程菌的培养过程包括:通过摇瓶操作确定：通过摇瓶操作确定：基因工程菌生长的基础条件基因工程菌生长的基础条件,如温度、如温度、pHpH、培、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响影响;通过培养罐操作确定：通过培养罐操作确
13、定：培养参数和控制方案以及顺序。培养参数和控制方案以及顺序。第十九页，讲稿共四十五页哦菌种菌种 一级种子摇瓶一级种子摇瓶 二级种子罐培养二级种子罐培养 扩大培养扩大培养 原料原料 发酵培养发酵培养 灭菌灭菌 发酵生产发酵生产 代谢产代谢产 物分离物分离 基配制基配制 微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图第二十页，讲稿共四十五页哦基因工程菌中试基因工程菌中试第二十一页，讲稿共四十五页哦第八节第八节 重组工程菌的培养重组工程菌的培养（batchculture）（fedbatchculture）（continuousculture）（dialysisculture）（immobilizedc
14、ulture）第二十二页，讲稿共四十五页哦 2.2.补料分批培养补料分批培养（fedfedbatchbatchcultureculture）v是将种子接入发酵反应器中进行培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基（溶氧控制、流加补料），使菌体进一步生长的方法。养基（溶氧控制、流加补料），使菌体进一步生长的方法。v良好的生长环境，延长对数生长期，获得高密度菌体。良好的生长环境，延长对数生长期，获得高密度菌体。第二十三页，讲稿共四十五页哦二、基因工程菌的培养工艺二、基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同基
15、因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基基因工程菌带外源基因因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。基因之间的相互关系还和环境有关。第二十四页，讲稿共四十五页哦工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响对发酵影响较大的几个因素有：较大的几个因素有：培养基的影响培养基的影响接种量的影响接种量的影响温度的影响温度的影响溶解氧的影响溶解氧的影响诱导时机的影响诱导时机的影响诱导表达程序的影响诱导表达程序的影响
16、 7.pH的影响的影响第二十五页，讲稿共四十五页哦 培养基的影响培养基的影响v培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。使外源基因高效表达。v常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。v常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。硫酸铵、氯化铵等。v还有无机盐、维生素等。还有无机盐、维生素等。第二十六页，讲稿共四十五页哦p不同的碳源对菌体的
17、生长和外源基因表达有较大的影响。不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。p使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。p葡萄糖对葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利启动子有利。第二十七页，讲稿共四十五页哦p在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trptrp启动启动子控制的基因有影响。子控制的基因有影响
18、。p无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。生长。第二十八页，讲稿共四十五页哦接种量的影响接种量的影响v 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。如如10%15%v 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。v 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。第二十九页，讲稿共四十五页哦p 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生接种量大，可缩短
19、生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。长期，适于表达外源基因。p 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长菌体的生长。第三十页，讲稿共四十五页哦 温度的影响温度的影响 温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译和小分子温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译和小分子调节分子的合成等水平上。调节分子的合成等水平上。温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。变菌
20、体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。vP-38第三十一页，讲稿共四十五页哦p 适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。温度。p高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。p 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。如：重组人生长激素，如：重组人生长激素，30 0C 产物可溶，产物可溶，37 0C 形成包含体形成包含体第三十二页，讲稿共四十五页哦 溶解氧的影响溶解氧的影响p 对于好氧发酵对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参
21、数。溶解氧浓度是重要的参数。p 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。p 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。第三十三页，讲稿共四十五页哦p发酵时，随发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更值下降，发酵后期下降幅度更大。大。p外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。p维持较高的维持较高的DO2值值(40%)，才能提高工程菌的生长，
22、利于外源蛋白产物的形成。，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。p采用调节搅拌转速的方法采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。第三十四页，讲稿共四十五页哦 诱导时机的影响诱导时机的影响p 对于对于PL或或PR启动子型的工程菌，使用启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突阻遏蛋白的温度敏感型突变株（变株（clts857），在），在2830 0C下培养时，该突变体能合成有活性的下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；启动子的转录；p 当当温度温度升高升高42 0C时，该阻遏蛋白失活，
23、使启动子启动转录，提高目的基时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。第三十五页，讲稿共四十五页哦p 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/mL 个为止，个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧营养和氧成了菌群旺盛成了菌群旺盛代谢的限制因素。代谢的限制因素。第三十六页，讲稿共四十五页哦 pH pH的影响的影响 pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影
24、响，对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pHpH进行适当的进行适当的调节。调节。第三十七页，讲稿共四十五页哦p如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其其最佳最佳pHpH在在6.86.87.47.4左右左右;p培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其其最佳最佳pHpH为为6.06.06.56.5。第三十八页，讲稿共四十五页哦最佳化的工艺是获得最佳化的工艺是获得（七最）（七最）:最快周期、最高产量、最好质量、
25、最低消耗、最大安全性、最周最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果和最低失败率。全的废物处理效果和最低失败率。第三十九页，讲稿共四十五页哦三、基因工程菌的培养设备三、基因工程菌的培养设备p应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。p基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。（基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。（细胞染色体之外细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因
26、合成的重组质粒上的外源基因合成）P-40第四十页，讲稿共四十五页哦 发酵罐的组成有：发酵罐的组成有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。液配制和连续操作系统。第四十一页，讲稿共四十五页哦 对发酵罐要求：对发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，培养过程不得污染，保证纯菌培养，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。第四十二页，讲稿共四十五页哦第四十三页，讲稿共四十五页哦第四十四页，讲稿共四十五页哦感谢大家观看感谢大家观看第四十五页，讲稿共四十五页哦