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1、关于基因工程制药(6)第一页，讲稿共五十二页哦用途：用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。获取方式：获取方式：生化提取生化提取 基因工程表达基因工程表达 成本高产量低成本高产量低质量难以保证质量难以保证成本低产量高成本低产量高活性强性质优活性强性质优实例：实例：人生长激素（侏儒症）人生长激素（侏儒症）50 具新鲜尸体具新鲜尸体脑下垂体中提取脑下垂体中提取采用基因工程从采用基因工程从 12 升细升细菌培养液中提取获得菌培养液中提取获得=第二页，讲稿共五十二页哦1
2、982 1982 年世界上第一个基因工程药物年世界上第一个基因工程药物 重组人胰岛素获准生产销售，重组人胰岛素获准生产销售，至今已有至今已有 100 100 多个生物技术药物上市多个生物技术药物上市;促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）以全球销售额）以全球销售额 38 38 亿美元的业绩，居全球最亿美元的业绩，居全球最畅销畅销 10 10 种药物的第种药物的第6 6名；名；1989 1989 年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物 -重组人重组人干扰素（干扰素（IFNIFN1b1b）上市以来，目前，世界上销售额排前）上市以来，目前，世界上
3、销售额排前 10 10 位的生物位的生物技术药物我国已能生产技术药物我国已能生产 8 8 种。种。国际生物医药产业发展动态国际生物医药产业发展动态第三页，讲稿共五十二页哦第一节第一节 概概 述述生物技术的核心就是基因工程，生物技术的核心就是基因工程，2020世纪世纪7070年代基因工程年代基因工程诞生诞生,最先应用在医药科学领域。最先应用在医药科学领域。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题支原体等的感染等问题（如：生长激素抑制素
4、（如：生长激素抑制素 1 mg 1 mg 传统法：传统法：1010万只羊的下丘脑，现：万只羊的下丘脑，现：10 L10 L大肠杆菌培养液，大肠杆菌培养液，0.30.3美元美元/mg/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。第四页，讲稿共五十二页哦应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题统生物制药所遇到的问题如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断药物已可通过分泌等方面的预防、治疗和诊断药物已可通过基
5、因工程技术获得。基因工程技术获得。第五页，讲稿共五十二页哦利用基因工程技术生产药品的优点：利用基因工程技术生产药品的优点：（1 1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；白和多肽；（2 2）可以提供足够数量的生理活性物质；）可以提供足够数量的生理活性物质；（3 3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源性生理活性物质；第六页，讲稿共五十二页哦（4 4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除内源性生理活性物质的不足之处。内源性生理活性物质的不足之处。（5 5）
6、利用基因工程技术可获得新型化合物，）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。扩大药物筛选来源。第七页，讲稿共五十二页哦第二节第二节 基因工程药物生产的过程基因工程药物生产的过程 基因工程技术基因工程技术是将所要重组对象的是将所要重组对象的目的目的基因基因插入载体、拼接，转入新的插入载体、拼接，转入新的宿主细胞宿主细胞，构建成工程菌构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞）或细胞）内进行复制和表达的技术。内进行复制和表达的技术。第八页，讲稿共五十二页哦基因工程药物生产的上游和下游基因工程药物生产
7、的上游和下游上游阶段：上游阶段：目的基因分离、工程菌（或细胞）目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游阶段：下游阶段：主要指的是从工程菌（或细胞）的主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制第九页，讲稿共五十二页哦获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物制备的一般过程
8、第十页，讲稿共五十二页哦基因工程基本过程基因工程基本过程切接转增检第十一页，讲稿共五十二页哦工程菌（或细胞）构建中重要的工具工程菌（或细胞）构建中重要的工具工具工具：酶：酶限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶逆转录酶逆转录酶Klenow Klenow 酶大片段（酶大片段（DNADNA聚合酶聚合酶 I I）核酸酶核酸酶S1S1第十二页，讲稿共五十二页哦第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？）（不能直接分离？）一、逆转录法一、逆转录法逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的就是先分离纯化目
9、的基因的mRNAmRNA，再反转，再反转录成录成 cDNAcDNA，然后进行，然后进行 cDNA cDNA 的克隆表达。的克隆表达。cDNAcDNA与模板与模板mRNAmRNA序列严格互补，而不含内含子。序列严格互补，而不含内含子。第十三页，讲稿共五十二页哦逆转录法的步骤逆转录法的步骤 1 1、mRNAmRNA的纯化的纯化 2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成 3 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成 4 4、cDNAcDNA克隆克隆 5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞 6 6、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定 7 7、目的、目的cDNAcDNA克隆的分
10、离和鉴定克隆的分离和鉴定第十四页，讲稿共五十二页哦cDNA克隆示意图克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S1第十五页，讲稿共五十二页哦不需合成第二链不需合成第二链mRNA逆转录酶ss-DNAPCR特异引物目的cDNA链19851985，PCRPCR发明以后，发明以后，RT-PCRRT-PCR得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。二、逆转录聚合酶链反应法（二、逆转录聚合酶链反应法（RT-PCRRT-PCR）第十六页，讲稿共五十二页哦 三、化学合成法三、化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因
11、可以用化学合成法合成。合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。酸顺序。人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，505060bp60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。中性突变；三是费用较高。第十七页，讲稿共五十二页哦四、筛选基因的新方法五、对已发现基因进行改造第十八页，讲稿共五十二页哦第四节第四节 基因表达基因表达 基因表达基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过
12、程。以及所有加工过程。基因高效表达基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基因：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使既获得原生物活性又可高产的表达产表达体系中，使既获得原生物活性又可高产的表达产物。物。最佳的基因表达体系最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化达产物稳定、表达产物容易分离纯化。第十九页，讲稿共五十二页哦一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择好培养，好培养，快速长，快速长，少危害，少危害，易重组，易重组，高量率，高量率，简提纯。简提纯。第二十页，讲稿共五十二页哦 宿主细胞常用两大类：宿主细胞常用两大类：原核细
13、胞原核细胞：常用有：常用有大肠杆菌大肠杆菌、枯草、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；芽胞杆菌、链霉菌等；真核细胞真核细胞：常用有：常用有酵母酵母、丝状真菌、丝状真菌、哺乳动物细胞等。哺乳动物细胞等。第二十一页，讲稿共五十二页哦原核细胞原核细胞 大肠杆菌：大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优点优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。胞破碎容易。缺点缺点：不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难；产品多为胞内产物，提
14、取困难；蛋白表达后不能修饰加蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）；工（糖基化等）；产物蛋白质产物蛋白质N N端多余一个蛋氨酸残基，端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应；能引起免疫反应；内毒素存留。内毒素存留。第二十二页，讲稿共五十二页哦 枯草芽胞杆菌：枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。物降解。链霉菌：链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。
15、第二十三页，讲稿共五十二页哦真核细胞真核细胞 酵母酵母 是研究基因表达最有效的单细是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。少真核基因成功表达。第二十四页，讲稿共五十二页哦 丝状真菌丝状真菌 优点优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。艺。哺乳动物细胞哺乳动物
16、细胞 优点优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。缺点缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。用高，培养液浓度稀。第二十五页，讲稿共五十二页哦二、大肠杆菌体系中的基因表达二、大肠杆菌体系中的基因表达（一）表达载体（一）表达载体表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件（1 1）载体能独立地进行复制）载体能独立地进行复制 (复制起点，复制起点，ori)ori)（2 2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记）应具有灵活的克
17、隆位点和方便的筛选标记（3 3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNARNA聚聚合酶所识别。合酶所识别。第二十六页，讲稿共五十二页哦（4 4）应具有阻遏子）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。当诱导时才进行转录。（5 5）应具有很强的终止子）应具有很强的终止子，以便使，以便使RNARNA聚合酶集聚合酶集中力量转录克隆的外源基因中力量转录克隆的外源基因.（6 6）所产生的）所产生的mRNAmRNA必须具有翻译的起始信号，必须具有翻译的起始信号，即起始密码即起始密码AUGAUG和和SDSD序列序列,以便转录后能顺利翻
18、译。以便转录后能顺利翻译。第二十七页，讲稿共五十二页哦常用表达载体常用表达载体 pBV220系统系统启动子启动子多克隆位点多克隆位点终止子终止子阻遏子阻遏子P23复制起始位点复制起始位点 它已成功地表达了它已成功地表达了人人白细胞介素白细胞介素2，干扰素干扰素和和肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子等外源基等外源基因。因。氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 限制性内切酶限制性内切酶 SD序列序列第二十八页，讲稿共五十二页哦 pBG-2 pBG-2是由是由pBV220pBV220系统衍生的便于产物系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。纯化的融合表达载体。该质粒在该质粒在P PR RP PL L启动子下游插
19、入启动子下游插入G G蛋白蛋白中与中与IgG FcIgG Fc段段结合的结构域基因片段结合的结构域基因片段180180个核苷个核苷酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与白的切点，具有与IgGIgG结合的活性，可用亲结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。和层析。简化下游工艺。pBG-2第二十九页，讲稿共五十二页哦（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的剂量外源基因的剂量 外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，总体表达水平提高外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，总体表达水平提高 外源基因的表达效
20、率外源基因的表达效率 与启动子强弱，核糖体结合位点的有效性，与启动子强弱，核糖体结合位点的有效性，SDSD序列与起始序列与起始密码的间距，密码子的组成等都影响其表达效率密码的间距，密码子的组成等都影响其表达效率第三十页，讲稿共五十二页哦 表达产物的稳定性表达产物的稳定性细胞代谢负荷细胞代谢负荷宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段工程菌的培养条件工程菌的培养条件优化工程菌培养条件，提高基因表达水平优化工程菌培养条件，提高基因表达水平第三十一页，讲稿共五十二页哦（三）（三）真核基因在大肠杆菌
21、中的表达形式真核基因在大肠杆菌中的表达形式 以以融合蛋白融合蛋白的形式表达药物基因的形式表达药物基因 以以原核多肽原核多肽和和真核蛋白真核蛋白结合在一起称融合蛋白。结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；实现高效表达；缺点：只能作抗原用。缺点：只能作抗原用。第三十二页，讲稿共五十二页哦 以非融合蛋白的形式表达药物基因以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的以真核蛋白的mRNAmRNA的的AUGAUG为起始，在其氨基为起始，在其氨基端不含细菌多肽
22、序列。端不含细菌多肽序列。优点优点：保持原有蛋白活性；：保持原有蛋白活性；缺点缺点：易被蛋白酶破坏。：易被蛋白酶破坏。第三十三页，讲稿共五十二页哦 分泌型表达蛋白药物基因分泌型表达蛋白药物基因 优点优点：在周质中稳定，有活性，不含：在周质中稳定，有活性，不含 蛋氨酸残基；蛋氨酸残基；缺点缺点：产量不高，：产量不高，信号肽不被切割。信号肽不被切割。第三十四页，讲稿共五十二页哦三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达（一）表达载体（一）表达载体 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的酵母分裂传递到子代细胞
23、的DNADNA或或RNARNA单位。单位。1.1.载体的复制序列载体的复制序列 酵母附加体质粒（酵母附加体质粒（yeast episomal plasmidyeast episomal plasmid，YepYep类）类）酵母复制型质粒（酵母复制型质粒（yeast replication plasmidyeast replication plasmid，YppYpp类）类）酵母着丝粒质粒（酵母着丝粒质粒（yeast centromeric plasmidyeast centromeric plasmid，YCpYCp类）类）酵母整合型质粒（酵母整合型质粒（yeast inteegrative
24、plasmidyeast inteegrative plasmid，YIpYIp类）类）第三十五页，讲稿共五十二页哦 2.2.克隆载体克隆载体 酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。3.3.表达载体表达载体 将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入上述载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。又分为普通表达载体和精确表达载体 第三十六页，讲稿共五十二页哦 普通表达载体普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。精确表达载体精确表达载
25、体，要求在启动子或信号肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。第三十七页，讲稿共五十二页哦（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 外源基因的剂量外源基因的剂量 外源基因的表达效率外源基因的表达效率 第三十八页，讲稿共五十二页哦外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响宿主菌株的影响(5)(5)培养条件培养条件第三十九页，讲稿共五十二页哦四、动物细胞中的基因表达四、动物细胞中的基因表达优点：产物类似于天然产物，容易分离纯化缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，
26、费用高培养液浓度较小。第四十页，讲稿共五十二页哦主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较
27、难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌第四十一页，讲稿共五十二页哦1 1、mRNAmRNA的纯化的纯化真核细胞真核细胞 mRNA 3-polyA mRNA 3-polyA（2020250)250)采用采用Oligo dT-Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将纤维素，以亲和层析法将mRNAmRNA从细胞总从细胞总RNARNA中分离出来。中分离出来。2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成 可用寡聚可用寡聚dTdT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNAcDNA链的合成。链
28、的合成。第四十二页，讲稿共五十二页哦3 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成除去除去cDNA-mRNAcDNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNAmRNA链链(碱解或碱解或RNaseHRNaseH酶解酶解)然后以然后以cDNAcDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNAcDNA链链3-3-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成始合成cDNAcDNA第二链第二链(常用常用KlenowKlenow酶或酶或DNADNA聚合酶聚合酶I I)切除发夹结构（切除发夹结构（核酸酶核酸酶S1S1，
29、专一性切除单链，专一性切除单链DNADNA）第四十三页，讲稿共五十二页哦4 4、cDNAcDNA克隆克隆用于用于cDNAcDNA克隆的载体有三类：克隆的载体有三类：细菌质粒细菌质粒（如（如pBR322pBR322、pUCpUC等）插入片段等）插入片段10kb10kb10kb 动植物病毒动植物病毒 根据重组后插入的根据重组后插入的cDNAcDNA能否经转录和翻译合成蛋白质能否经转录和翻译合成蛋白质 非表达型载体非表达型载体（pBR322pBR322及及 gt10 gt10）表达型载体表达型载体（pUCpUC及及 gt11 gt11）有利于目的基因的筛选）有利于目的基因的筛选 第四十四页，讲稿共五
30、十二页哦5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞1 1、转化：、转化：指质粒指质粒DNA DNA 或以它为载体构建的重组或以它为载体构建的重组DNA DNA 导入细菌的导入细菌的过程。过程。2 2、转染、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。脂质体介导：脂质体介导：原生质体融合：原生质体融合：电穿孔：电穿孔：显微注射：显微注射：基因枪：基因枪：病毒介导：病毒介导：农杆菌转染：农杆菌转染：第四十五页，讲稿共五十二页哦6 6、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定1 1、表型改变：、表型改变：抗生素抗性抗生素抗性（抗性基因
31、失活和菌落或噬菌斑颜色改变）（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变）a a互补：互补：报告基因：报告基因：缺陷恢复：缺陷恢复：2 2、结构特征：、结构特征：DNADNA大小：大小：酶切图谱：酶切图谱：杂交（核酸、蛋白）：杂交（核酸、蛋白）：PCRPCR检测：检测：DNADNA序列分析序列分析3 3、免疫化学检测：、免疫化学检测：表达产物分析表达产物分析第四十六页，讲稿共五十二页哦7 7、目的、目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定从从cDNAcDNA文库中分离特异的文库中分离特异的cDNAcDNA克隆，主要采用：克隆，主要采用：（1 1）核酸探针杂交法。）核酸探针杂交法。根据目的蛋
32、白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从苷酸作为探针，从cDNAcDNA文库中分离特异文库中分离特异cDNAcDNA克隆。克隆。（2 2）免疫反应鉴定法。）免疫反应鉴定法。用表达型载体构建的用表达型载体构建的cDNAcDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各各cDNAcDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNAcDNA克隆。克隆。第四十七页，讲稿共五十二页哦外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 转
33、录转录翻译翻译第四十八页，讲稿共五十二页哦 启动子和终止子的强弱；启动子和终止子的强弱；大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。第四十九页，讲稿共五十二页哦 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的转录启动
34、的频率频率，而且在很大程度上还与，而且在很大程度上还与 mRNA mRNA 的的翻译起始效率翻译起始效率密切相关。密切相关。mRNA mRNA 翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其 5 5 端的结构序列（消除二级端的结构序列（消除二级结构）所决定，称为结构）所决定，称为核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBSRBS）。）。核糖体结合位点的有效性核糖体结合位点的有效性第五十页，讲稿共五十二页哦 SD SD 序列与翻译起始密码子之间的距离序列与翻译起始密码子之间的距离 SDSD序列与起始密码子序列与起始密码子AUGAUG之间的精确距离保证了之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体在核糖体上定位后，翻译起始密码子上定位后，翻译起始密码子 AUGAUG 正好处于正好处于核糖体复合物结构中的核糖体复合物结构中的 P P 位位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD SD 序列位于序列位于 AUG AUG 之前大约之前大约七个七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。第五十一页，讲稿共五十二页哦感感谢谢大大家家观观看看第五十二页，讲稿共五十二页哦