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1、蛋白质的修饰和表达2022/9/272022/9/271 1第1页，此课件共62页哦主要内容主要内容第一节第一节 蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的化学途径(P88-94(P88-94(P88-94(P88-94 自自自自学学学学)第二节第二节第二节第二节 蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径第三节第三节第三节第三节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达第2页，此课件共62页哦 第二节第二节 蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术基因突变技术基因突变技术基因突变技术是通过在基
2、因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。分类：分类：分类：分类：位点特异性突变位点特异性突变位点特异性突变位点特异性突变基因突变技术基因突变技术基因突变技术基因突变技术（按特点划分）（按特点划分）（按特点划分）（按特点划分）随机突变随机突变随机突变随机突变 第3页，此课件共62页哦
3、 1)1)1)1)通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变位点特异性突变位点特异性突变 2)2)2)2)盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变 3)3)3)3)以双链以双链以双链以双链DNADNADNADNA为模板，利用为模板，利用为模板，利用为模板，利用PCRPCRPCRPCR 技术进行的基因突变技术进行的基因突变技术进行的基因突变技术进行的基因突变可以这样说，可以这样说，PCRPCR技术的出现为基因的突变，基因技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路
4、的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生序列上产生插入、缺失、取代插入、缺失、取代等突变。等突变。第4页，此课件共62页哦 1 1编码基因的专一性位点突变编码基因的专一性位点突变 定义定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是这种突变的方法从问世
5、至今不断更新，特别是这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCRPCRPCRPCR技术出技术出技术出技术出现后变得更高效。现后变得更高效。现后变得更高效。现后变得更高效。(1)(1)(1)(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2)(2)(2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 第5页，此课件共62页哦(1)(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介
6、导的基因突变中的各种因素DNADNA模板的制备模板的制备 对于单链对于单链对于单链对于单链DNADNADNADNA模板一定要高纯度，即使少量的模板一定要高纯度，即使少量的模板一定要高纯度，即使少量的模板一定要高纯度，即使少量的RNARNA分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性。双链双链DNADNA：一般制备一般制备DNADNA质粒质粒 的方法均可的方法均可单链单链DNADNA：通过通过M13M13噬菌体或噬菌体或 噬菌粒来制备噬菌粒来制备第6页，此课件共62页哦 核甘酸突变引物的设计和选择核甘酸突变引物的设计和选择a.a.必须与模板链上
7、的目标必须与模板链上的目标DNADNA序列有必要的序列有必要的互补区互补区b.b.足够长，以便与目标足够长，以便与目标DNADNA序列退火序列退火c.c.突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列构的回文序列、重复序列或自身互补序列d.d.突变引物要特异，不能与目标突变引物要特异，不能与目标DNADNA中突变中突变位置以外的位置以外的DNADNA形成非特异性的杂交混合形成非特异性的杂交混合体体第7页，此课件共62页哦例子例子：将：将NCBINCBI数据库中的数据库中的MADSMADS基因编码蛋白质的基因编码蛋白质的“KKACSD
8、SSA”KKACSDSSA”中的中的C C（CysCys）定点突变为）定点突变为A A（ArgArg）。）。第8页，此课件共62页哦第9页，此课件共62页哦第10页，此课件共62页哦第11页，此课件共62页哦第12页，此课件共62页哦核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板DNADNADNADNA的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板DNADNADNADNA的比率的比率的比率的比率 一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔
9、比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在1010101050505050：1 1 1 1之间。之间。之间。之间。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的TmTmTmTm值以上值以上值以上值以上20202020，然后再慢慢，然后再慢慢，然后再慢慢，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。引物
10、延伸引物延伸引物延伸引物延伸 加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的dNTPdNTPdNTPdNTP、ATPATPATPATP、DNADNADNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、DNADNADNADNA连接酶等。连接酶等。连接酶等。连接酶等。在适当温度下进行在适当温度下进行在适当温度下进行在适当温度下进行215h215h215h215h的连接。的连接。的连接。的连接。第13页，此课件共62页哦DNADNA聚合酶的选择聚合酶的选择T4DNA聚合酶聚合酶T7DNA聚合酶聚合酶Klenow酶酶 在单引物的延伸反应中，避免使用不当在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置
11、换，导致突变效率降低。的酶引起引物置换，导致突变效率降低。第14页，此课件共62页哦dNTPdNTPdNTPdNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体DNADNADNADNA合成的影响合成的影响合成的影响合成的影响dNTP纯度要高纯度要高 dCTPdCTP氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量dUTPdUTP，当多核苷，当多核苷酸中搀入酸中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶-N-N-糖基化酶可糖基化酶可糖基化酶可糖基化酶可在在在在U U的位置切断的位置切断的位置切断的位置切断
12、DNA链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的DNA聚合酶能够聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。产生切口平移，从而降低突变体的产率。第15页，此课件共62页哦受体细胞对突变体产率的影响受体细胞对突变体产率的影响大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统 解决方案：采用错配修复系统缺失的系解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。统菌株作为受体菌。当用当用M13作为克隆载体时，作为克隆载体时，M13可能会出现可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影响不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果试验结果第16页，此课件共62页哦(
13、2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel Kunkel Kunkel Kunkel 突变法突变法突变法突变法 基于抗生素抗性基于抗生素抗性基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复回复回复”的突变方法的突变方法的突变方法的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)(PCR)(PCR)产生定点突变产生定点突变产生定点突变产生定点突变第17页，此课件共62页哦 Kunkel Kunkel
14、 突变法突变法1.1.KunkelKunkel 1985 1985年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：第18页，此课件共62页哦具体步骤：具体步骤：具体步骤：具体步骤：将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNAM13 DNA载体上，载体上，载体上，载体上，导入具有导入具有导入具有导入具有dUTPdUTP酶（酶（酶（酶（dutdut）和）和）和）和N-N-尿嘧啶脱尿嘧啶脱尿嘧啶脱尿嘧啶脱糖苷酶（糖苷酶（糖苷酶（糖苷酶（ungung）双缺陷的大肠杆菌（）双缺陷的大肠杆菌（）双缺陷的大肠杆菌（）双缺陷的大肠杆菌（dut-dut-
15、，ung-ung-）菌株）菌株）菌株）菌株中。中。中。中。DutDut缺陷缺陷缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内导致细胞内导致细胞内dUTPdUTP水平上升水平上升水平上升水平上升，并，并，并，并在在在在DNADNA复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代dTTPdTTP进入进入进入进入DNADNA新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于ungung缺陷缺陷缺陷缺陷使掺入使掺入使掺入使掺入DNADNA的的的的dUTPdUTP残基不能除去残基不能除去残基不能除去残基不能除去。由这种大肠。由这种大肠。由这种大肠。由这种大肠杆菌菌株产生的杆菌菌株产生的杆菌菌
16、株产生的杆菌菌株产生的M13M13单链单链单链单链DNADNA大约有大约有大约有大约有1%1%的的的的T T被被被被U U所取代所取代所取代所取代，然后进行，然后进行，然后进行，然后进行DNADNA定点突变。定点突变。定点突变。定点突变。双链双链双链双链DNADNA导入正常的大肠杆菌中，其尿导入正常的大肠杆菌中，其尿导入正常的大肠杆菌中，其尿导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶N-N-糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去DNADNA链上的尿嘧啶链上的尿嘧啶链上的尿嘧啶链上的尿嘧啶碱基。碱基。碱基。碱基。结果原来的结果原来的结果原来的结果原来的M13M13模板链被降解，只有突模
17、板链被降解，只有突模板链被降解，只有突模板链被降解，只有突变链因不含变链因不含变链因不含变链因不含U U，被保留下来。这种方法产，被保留下来。这种方法产，被保留下来。这种方法产，被保留下来。这种方法产生的生的生的生的M13M13噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变DNADNA的比的比的比的比例大大增加。例大大增加。例大大增加。例大大增加。第19页，此课件共62页哦 基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复”的突变方法的突变方法第20页，此课件共62页哦 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变第21页，此课件共62页哦第22页，此课件共62页哦 利
18、用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)产生产生定点突变定点突变 5端或端或3端区产生突变端区产生突变直接直接PCR 中心区突变中心区突变重叠延伸（重叠延伸（overlap extension）新概念新概念：Gene SOEing:即通过重叠延伸进行剪接即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）,也就是说通过重组延伸方也就是说通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起法将不同的基因进行剪接和组合在一起。第23页，此课件共62页哦DNADNA片片段段的的剪剪切切第24页，此课件共62页哦取代突变取代突变第25页，此课件共62页哦插入突变插
19、入突变第26页，此课件共62页哦缺失突变缺失突变第27页，此课件共62页哦 2 2区域性定向突变区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。生区域性的突变。生区域性的突变。生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesi
20、s)(cassette mutagenesis)，又称片段，又称片段，又称片段，又称片段取代法取代法取代法取代法(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列酶位点，用具有任何长度、任何序
21、列酶位点，用具有任何长度、任何序列酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列或任何混合序列或任何混合序列或任何混合序列)的的的的DNADNADNADNA片片片片段来置换或取代目标基因上的一段段来置换或取代目标基因上的一段段来置换或取代目标基因上的一段段来置换或取代目标基因上的一段DNADNADNADNA序列。序列。序列。序列。第28页，此课件共62页哦研究目的研究目的 通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的功能之间的功能之间的功能之间的关系，也可以通过盒式
22、突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。酸序列来置换。酸序列来置换。酸序列来置换。盒式突变盒式突变盒式突变盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，最主要的
23、用途是产生各种特异性的突变或突变家族，最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。个切实可行的方法。
24、个切实可行的方法。个切实可行的方法。第29页，此课件共62页哦二、基因融合和基因剪接二、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由2 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接第30页，此课件共62页哦1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘利用基因融合技术表达外源基因的缘由由外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通过与特异蛋白质或特异的结构
25、域形成融合蛋白，利于快速回收、通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化纯化纯化纯化融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成
26、通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体包涵体包涵体包涵体基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究研究研究研究第31页，此课件共62页哦2 21 1 基因融合的策略基因融合的策略将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后将外源基因本身按阅读框架自我融合。对将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非一些小肽的稳定表达、表达产物
27、的活性非常重要常重要目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C C端或端或N N端融合端融合第32页，此课件共62页哦分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异源或载体蛋白融合源或载体蛋白融合源或载体蛋白融合源或载体蛋白融合分泌插入融合法
28、。此法是将目标基因插入到信号肽序列分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码胞壁的蛋白编码胞壁的蛋白编码胞壁的蛋白编码 设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融设
29、计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合物物物物21 基因融合的策略基因融合的策略第33页，此课件共62页哦2.2 产生蛋白质分子嵌合体的策略产生蛋白质分子嵌合体的策略通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接 条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条
30、件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接 条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列通过通过通过通过PCRPCR双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法 该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，将两个编码不同蛋白质的将两个编码不同蛋白质的将两个编码
31、不同蛋白质的将两个编码不同蛋白质的DNADNA分子重组，形成分子重组，形成分子重组，形成分子重组，形成DNADNA分子分子分子分子嵌合体嵌合体嵌合体嵌合体第34页，此课件共62页哦第35页，此课件共62页哦3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接连接n1990年年Saccharomydes cerevisiae发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质会发生自我剪接（质会发生自我剪接（protein splicing），从而首次发现第一个蛋），从而首次发现第一个蛋白质内含子白质内含子Sce VMA n蛋白质内含子蛋白质内含子(intein)
32、是蛋白质中是蛋白质中的一段多肽链的一段多肽链,它靠自我剪切的方它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来式从前体蛋白中分离出来,而两端的而两端的外显子以肽键的方式相连外显子以肽键的方式相连 第36页，此课件共62页哦基因融合的用途基因融合的用途上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达表达产物的分离表达产物的分离表达产物的分离表达产物的分离纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位 作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋
33、白质分子中作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。第37页，此课件共62页哦 第三节第三节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达重组蛋白质
34、在哺乳类动物细胞中的表达第38页，此课件共62页哦 一、大肠杆菌中表达体系的优点一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌(E.coliE.coli)表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：1 1）遗传学和
35、生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚；2 2）容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵；3 3）外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达。第39页，此课件共62页哦大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是：大肠杆菌系统最大的不足之处是：（1 1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典
36、型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷，如糖基化、烷基化、磷，如糖基化、烷基化、磷，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；酸化、特异性的蛋白水解加工等；酸化、特异性的蛋白水解加工等；酸化、特异性的蛋白水解加工等；（2 2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制制制制。（3 3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形
37、成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；（4 4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的然保留在蛋白质的然保留在蛋白质的然保留在蛋白质的N N末端末端末端末端。最后，由于真核最后，由于真核最后，由于真核最后，由于真核mRNAmRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差的结构特性以及密码子使用频率与
38、大肠杆菌本身的差的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核异，当用真核异，当用真核异，当用真核mRNAmRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5 5）有时不能有时不能有时不能有时不能得到足够的产物得到足够的产物得到足够的产物得到足够的产物。第40页，此课件共62页哦大肠杆菌表达体系的应用大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的当外源蛋白质的当外源蛋白质的当外源蛋白质的分子量小于分子量小于分子量小于分子量小于70kD70kD,不存在
39、半胱氨酸不存在半胱氨酸不存在半胱氨酸不存在半胱氨酸或或分子内的二硫键少于分子内的二硫键少于分子内的二硫键少于分子内的二硫键少于3 34 4个个，以及，以及，以及，以及不需要翻译后修不需要翻译后修不需要翻译后修不需要翻译后修饰饰饰饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。菌系统得到满意的结果。菌系统得到满意的结果。菌系统得到满意的结果。第41页，此课件共62页哦1表达载体的一般特点表达载体的一般特点(1)(1)复制起始点复制起始点复
40、制起始点复制起始点(2)(2)选择性基因选择性基因(3)(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列强的转录终止序列(5)(5)核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点(6)(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点合适的多克隆位点合适的多克隆位点第42页，此课件共62页哦(1)复制起始点复制起始点绝大多数载体利用绝大多数载体利用pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的质粒来源的复制起始点（如，复制起始点（如，pET28pET28系列）系列）复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数
41、pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的质粒可保持质粒来源的质粒可保持20205050个拷贝数和个拷贝数和150200150200个拷贝数个拷贝数第43页，此课件共62页哦(2)选择性基因选择性基因 载体上要含有至少一个选择性基因载体上要含有至少一个选择性基因作用：作用：1）保证对转化体的筛选）保证对转化体的筛选 2）保证在培养过程中受体细胞质粒）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失不丢失种类：种类：第44页，此课件共62页哦(3)(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子原核细胞的启动子包括了原核细胞的启动子包括了RNARNA聚合酶的识别聚合酶的识别位点和结合位点位点和结合位点启
42、动子序列通常包含了启动子序列通常包含了1010区（区（TATAATTATAAT）和）和3535区（区（TTGACATTGACA）常用的种类：常用的种类：LacUV5LacUV5、trptrp、tactac、trctrc以及以及T7T7启动子启动子RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位点第45页，此课件共62页哦(4)强的转录终止序列强的转录终止序列 为使目标基因有效的转录，需要满足两个条为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件：件：转录终止序列转录终止序列抗转录终止序列抗转录终止序列 减少不必需的转录通过减少不必需的转录通过复制起始位点，其作用可以复制起
43、始位点，其作用可以帮助稳定帮助稳定mRNA，增加，增加mRNA的半衰期的半衰期 保证目标保证目标基因完全被基因完全被转录转录第46页，此课件共62页哦(5)核糖体结合位点核糖体结合位点位置：位于启动子下游，翻译起始密码位置：位于启动子下游，翻译起始密码ATGATG的上游的上游核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列，对原核细胞序列，对原核细胞mRNAmRNA翻译起始非常关键翻译起始非常关键第47页，此课件共62页哦(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上用于构建或改造载体用于构建或改造载体用于构建或改造载体用于构建或改造载体第48页，此课件共6
44、2页哦2与外源基因有效表达的相关因素与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始有效的转录起始(2)(2)有效的翻译有效的翻译(3)(3)蛋白质水解作用蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌蛋白质的外泌蛋白质的外泌蛋白质的外泌 第49页，此课件共62页哦(1)有效的转录起始有效的转录起始转录起始的速率是基因转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤表达的主要限速步骤高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：1 1 1 1）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱 2 2 2 2）调控序列）调控序列）调控序列）调控序列第50页，此课件共62页哦(2)
45、有效的翻译有效的翻译mRNAmRNA的稳定性的稳定性翻译起始的频率翻译起始的频率肽链延伸肽链延伸 和终止的速率和终止的速率翻译的忠实性翻译的忠实性mRNAmRNA转录速率越高转录速率越高mRNAmRNA降解速率越低降解速率越低高高核糖体结合位点（核糖体结合位点（SDSD序列）序列）SDSD序列与起始密码之间的距离序列与起始密码之间的距离起始密码上游区的序列起始密码上游区的序列SDSD序列与可翻译序列序列与可翻译序列55端形成的二级结构端形成的二级结构遗传密码的使用（高频或低频）遗传密码的使用（高频或低频）等等多加入终止密码子（串联终止多加入终止密码子（串联终止子）子）错误氨基酸的搀入错误氨基酸
46、的搀入第51页，此课件共62页哦(3)蛋白质水解作用蛋白质水解作用合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是信号信号信号信号肽酶肽酶肽酶肽酶I I I I（LepLepLepLep）或）或）或）或信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽酶IIIIIIII（LspLspLspLsp）将分泌（或外运）将分泌（或外运）将分泌（或外运）将分泌（或外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于蛋白质上的信号肽切除；
47、一类是对存在于蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于N N末端的末端的末端的末端的甲甲甲甲硫氨酸进行加工硫氨酸进行加工硫氨酸进行加工硫氨酸进行加工蛋白质的降解蛋白质的降解蛋白质的降解蛋白质的降解 大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶第52页，此课件共62页哦(4)蛋白质的外泌蛋白质的外泌外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质膜外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质膜外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质膜外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统
48、相容，可以穿过细胞质膜进入周质，这一过程称为外泌（进入周质，这一过程称为外泌（进入周质，这一过程称为外泌（进入周质，这一过程称为外泌（exportexport）分泌（分泌（分泌（分泌（secretionsecretion）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的周质中周质中周质中周质中的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内氧化性要强氧化性要强氧化性要
49、强氧化性要强，利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害，如水，如水，如水，如水解酶和解酶和解酶和解酶和DNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的N N端端端端蛋白的外泌，特别是分泌到
50、培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化第53页，此课件共62页哦 3改善表达水平的方法改善表达水平的方法 诱导条件诱导条件外源基因的编码序列外源基因的编码序列用蛋白酶缺失的宿主菌用蛋白酶缺失的宿主菌第54页，此课件共62页哦诱导条件诱导条件诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）培养基组成培养基组成培养基组成培养基组成第55页，此课件共62页哦外源基因的编码序列外源基因的编码序列1.1.利用密码简并原理