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1、第三章第三章 蛋白质的修饰和表达蛋白质的修饰和表达 蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。组蛋白质的表达进行讲解。第一节第一节 蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的化学途径蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变。一、蛋白质侧
2、链的化学修饰一、蛋白质侧链的化学修饰n在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。n因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。n蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。M13 (a filamentous phage con
3、taining ss-DNA encased in a proteincoat): contains five coat proteins, two of which aregVIIIp (gene VIII protein) and gIIIp (gene III protein).二、基因融合和基因剪接二、基因融合和基因剪接1利用基因融合技术表达外源基因的缘由（1）通过与一特异性蛋白质或其特意的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯化。（2）通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白。（3）与报告分子的融合蛋白结合，应用于蛋白质定位或转基因动物。（4.）避免被蛋白水解酶
4、水解（5）改变细胞溶解性，防止包涵体的形成（6）定向定位在宿主的不同区位。2基因融合的策略（1）方式A酶切后，直接剪接到适当的信号肽之后B在目的基因两端分别加上不同的亲和标签，有利于蛋白纯化C将目标基因插入信号肽序列和一插入序列之间，成为一种可插入到细胞膜和细胞壁的蛋白编码。基因融合的用途基因融合的用途 上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。n重组蛋白质在大肠杆菌中的表达n重组蛋白质在酵母细胞中的表达n重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达一、大肠杆菌
5、中表达体系的优点一、大肠杆菌中表达体系的优点n大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。n利用大肠杆菌作为表达体系的优点：n遗传学和生理学背景清楚；n容易培养，特别是高密度发酵；n外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点n大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。n大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大
6、肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。大肠杆菌表达体系的应用大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于34个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。(1) 复制起始点 大部分载体是基于pBR322或pUC质粒的复制起始点，复制起点主要决定了细胞内质粒的拷贝数。前者可保持每个细胞中20-50个拷贝，后者为150-200个质粒
7、。(2)选择性基因 载体上至少含有一个选择性基因，一方面用于对转化体的确定，另一方面在培养过程中保持质粒的稳定性。一般为抗生素抗性基因或报道基因。(3) 强的、可诱导的启动子(4) 强的转录终止序列 高效表达的载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。(5) 核糖体结合位点原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列。SD序列对翻译效率有影响。n(6) 合适的多克隆位点n具有多个单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因插入和筛选。2与外源基因有效表达的相关因素与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始一个合适的高表达外
8、源基因的启动子应符合以下几点：第一，必须是较强的启动子，表达效率在10-30%。第二，由启动子控制的本底转录很低。第三，启动子能够有一些简单及经济合算的方式诱导启动。例如：T7启动子(2)转录终止区对外源基因表达效率的影响转录终止有两种机制，一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板脱离。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖与模板上编码的信号。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成启动子的封堵。(4)密码子偏好性遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用其中一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子，不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子
9、。富含E.coli不常用密码子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。精氨酸tRNA是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。 三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的优点n哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。n哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。n实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达
10、tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。分泌型哺乳动物细胞表达系统分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处 是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体
11、基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。n在哺乳动物细胞中有三个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，二是稳定表达系统，三是诱导表达系统。n瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。n稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要12个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。n诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。