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1、关于蛋白质的修饰和表达19.09.202219.09.20221 1第一张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222 2 第二节第二节 蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术基因突变技术基因突变技术基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。
2、在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。分类：分类：分类：分类：位点特异性突变位点特异性突变位点特异性突变位点特异性突变基因突变技术基因突变技术基因突变技术基因突变技术（按特点划分）（按特点划分）（按特点划分）（按特点划分）随机突变随机突变随机突变随机突变 第二张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223 3 1)1)1)1)通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变位点特异性突变位点特异性突变 2)2)2)2)盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变盒式突变或片
3、段取代突变 3)3)3)3)以双链以双链以双链以双链DNADNADNADNA为模板，利用为模板，利用为模板，利用为模板，利用PCRPCRPCRPCR 技术进行的基因突变技术进行的基因突变技术进行的基因突变技术进行的基因突变可以这样说，可以这样说，PCRPCR技术的出现为基因的突变，基因技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生序列上产生插入、缺失、取代插入、缺失、取代等突变。等突变。第三张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19
4、.09.202219.09.20224 4 1 1编码基因的专一性位点突变编码基因的专一性位点突变 定义定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为此又称为此又称为此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变。这种突变。这种突变。这种突变的方
5、法从问世至今不断更新，特别是的方法从问世至今不断更新，特别是的方法从问世至今不断更新，特别是的方法从问世至今不断更新，特别是PCRPCRPCRPCR技术出现后变技术出现后变得更高效。得更高效。(1)(1)(1)(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2)(2)(2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 第四张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20225 5(1)(
6、1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素DNADNA模板的制备模板的制备 对于单链对于单链DNADNADNADNA模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量的的的的RNARNA分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性。双链双链DNADNA：一般制备一般制备DNADNA质粒质粒 的方法均可的方法均可单链单链DNADNA：通过通过M13M13噬菌体或噬菌体或 噬菌粒来制备噬菌粒来制备第五张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20226 6 核甘酸突变引物的设计和
7、选择核甘酸突变引物的设计和选择a.a.a.a.必须与模板链上的目标必须与模板链上的目标DNADNA序列有必要的互补序列有必要的互补区区b.b.b.b.足够长，以便与目标足够长，以便与目标DNADNA序列退火序列退火c.c.c.c.突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结构的突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列回文序列、重复序列或自身互补序列d.d.突变引物要特异，不能与目标突变引物要特异，不能与目标DNADNA中突变位置中突变位置以外的以外的DNADNA形成非特异性的杂交混合体形成非特异性的杂交混合体第六张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.20
8、2219.09.20227 7例子例子：将：将NCBINCBI数据库中的数据库中的MADSMADS基因编码蛋白质的基因编码蛋白质的“KKACSDSSA”KKACSDSSA”中的中的C C（CysCys）定点突变为）定点突变为A A（ArgArg）。）。第七张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20228 8第八张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20229 9第九张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221010第十张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219
9、.09.20221111第十一张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221212核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板DNADNADNADNA的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板DNADNADNADNA的比率的比率的比率的比率 一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在1010101050505050：1 1 1
10、1之间。之间。之间。之间。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的TmTmTmTm值以上值以上值以上值以上20202020，然后再慢慢，然后再慢慢，然后再慢慢，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。冷却至较低温度，形成双链。引物延伸引物延伸引物延伸引物延伸 加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的dNTPdNTPdNTPdN
11、TP、ATPATPATPATP、DNADNADNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、DNADNADNADNA连接酶等。连接酶等。连接酶等。连接酶等。在适当温度下进行在适当温度下进行在适当温度下进行在适当温度下进行222215h15h15h15h的连接。的连接。的连接。的连接。第十二张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221313DNADNA聚合酶的选择聚合酶的选择T4DNA聚合酶聚合酶T7DNA聚合酶聚合酶Klenow酶酶 在单引物的延伸反应中，避免使用不当的在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置换，导致突变效率降低。酶引起引物置换，导致
12、突变效率降低。第十三张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221414dNTPdNTPdNTPdNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体DNADNA合成的影响合成的影响合成的影响合成的影响dNTP纯度要高纯度要高 dCTPdCTP氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量dUTPdUTP，当多核苷酸，当多核苷酸，当多核苷酸，当多核苷酸中搀入中搀入中搀入中搀入UMPUMP时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶-N-N
13、-糖基化酶可在糖基化酶可在糖基化酶可在糖基化酶可在U U的位置切断的位置切断的位置切断的位置切断DNADNA链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的DNA聚合酶能够产生切聚合酶能够产生切聚合酶能够产生切聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。口平移，从而降低突变体的产率。口平移，从而降低突变体的产率。口平移，从而降低突变体的产率。第十四张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221515受体细胞对突变体产率的影响受体细胞对突变体产率的影响大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统 解决方案：采用错配修复系统缺失的
14、系统解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。菌株作为受体菌。当用当用M13作为克隆载体时，作为克隆载体时，M13可能会出现不可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果结果第十五张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221616(2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel Kunkel Kunkel Kunkel 突变法突变法突变法突变法 基于抗生素抗性基于抗生素抗性基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复回复回复”的突变方法的突变方法的突变方法的突变
15、方法 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)(PCR)(PCR)产生定点突变产生定点突变产生定点突变产生定点突变第十六张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221717 Kunkel Kunkel 突变法突变法1.1.KunkelKunkel 1985 1985年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：第十七张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.
16、09.20221818具体步骤：具体步骤：具体步骤：具体步骤：将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNAM13 DNA载体上，载体上，载体上，载体上，导入具有导入具有导入具有导入具有dUTPdUTP酶（酶（酶（酶（dutdut）和）和）和）和N-N-尿嘧啶脱尿嘧啶脱尿嘧啶脱尿嘧啶脱糖苷酶（糖苷酶（糖苷酶（糖苷酶（ungung）双缺陷的大肠杆菌）双缺陷的大肠杆菌）双缺陷的大肠杆菌）双缺陷的大肠杆菌（dut-dut-，ung-ung-）菌株）菌株）菌株）菌株中。中。中。中。DutDut缺陷缺陷缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内导致细胞内导致细胞内dUT
17、PdUTP水平上升水平上升水平上升水平上升，并，并，并，并在在在在DNADNA复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代dTTPdTTP进入进入进入进入DNADNA新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于ungung缺陷缺陷缺陷缺陷使掺入使掺入使掺入使掺入DNADNA的的的的dUTPdUTP残基不能除去残基不能除去残基不能除去残基不能除去。由这种大肠。由这种大肠。由这种大肠。由这种大肠杆菌菌株产生的杆菌菌株产生的杆菌菌株产生的杆菌菌株产生的M13M13单链单链单链单链DNADNA大约有大约有大约有大约有1%1%的的的的T T被被被被U U所取代所取
18、代所取代所取代，然后进行，然后进行，然后进行，然后进行DNADNA定点突变。定点突变。定点突变。定点突变。双链双链双链双链DNADNA导入正常的大肠杆菌中，其导入正常的大肠杆菌中，其导入正常的大肠杆菌中，其导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶N-N-糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去DNADNA链上的尿嘧链上的尿嘧链上的尿嘧链上的尿嘧啶碱基。啶碱基。啶碱基。啶碱基。结果原来的结果原来的结果原来的结果原来的M13M13模板链被降解，只有突模板链被降解，只有突模板链被降解，只有突模板链被降解，只有突变链因不含变链因不含变链因不含变链因不含U U，被保留下来。这种方法，被保
19、留下来。这种方法，被保留下来。这种方法，被保留下来。这种方法产生的产生的产生的产生的M13M13噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变DNADNA的比的比的比的比例大大增加。例大大增加。例大大增加。例大大增加。第十八张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20221919 基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复”的突变方法的突变方法第十九张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222020 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变第二十张，PPT共六十四页，创作于2022年6月
20、19.09.202219.09.20222121第二十一张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222222 利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)产生定产生定点突变点突变 5端或端或3端区产生突变端区产生突变直接直接PCR 中心区突变中心区突变重叠延伸（重叠延伸（overlap extension）新概念新概念：Gene SOEing:即通过重叠延伸进行剪接即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）,也就是说通过重组延伸也就是说通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起方法将不同的基因进行剪接
21、和组合在一起。第二十二张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222323DNADNA片段片段的剪的剪切切第二十三张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222424取代突变取代突变第二十四张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222525插入突变插入突变第二十五张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222626缺失突变缺失突变第二十六张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222727 2 2区域性定
22、向突变区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。域性的突变。域性的突变。域性的突变。常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)，又称片段取，又称片段取，又称片段取，又称
23、片段取代法代法代法代法(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列切酶位点，用具有任何长度、任何序列切酶位点，用具有任何长度、任何序列切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列或任何混
24、合序列或任何混合序列或任何混合序列)的的的的DNADNADNADNA片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段DNADNADNADNA序列。序列。序列。序列。第二十七张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222828研究目的研究目的 通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间功能之间功能之间功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在
25、这个嵌合的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。基酸序列来置换。基酸序列来置换。基酸序列来置换。盒式突变盒式突变盒式突变盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家最主要的用途是产生各种特异性的突变
26、或突变家最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。的结构和功能提供了一个切实可行的方法。的结构和功能提供了一个切实可行的方法。的结构和功能提供了一
27、个切实可行的方法。第二十八张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20222929二、基因融合和基因剪接二、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由2 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接第二十九张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202230301 1利用基因融合技术表达外源基因的缘利用基因融合技术表达外源基因的缘由由外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通
28、常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化回收、纯化回收、纯化回收、纯化融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细通
29、过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体胞内形成包涵体胞内形成包涵体胞内形成包涵体基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究能的研究能的研究能的研究第三十张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202231312 21 1 基因融合的策略基因融合的策略将重组基因直
30、接剪接于适当的信号肽之后将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C C端或端或N N端融合端融合第三十一张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223232分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因双亲和融合法。即将目标基因
31、与两个不同配基有特异亲和双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异源或载体蛋白融合的异源或载体蛋白融合的异源或载体蛋白融合的异源或载体蛋白融合分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编入序列之间，此插入
32、序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码码码码 设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合物生具有免疫原的复合物生具有免疫原的复合物生具有免疫原的复合物21 基因融合的策略基因融合的策略第三十
33、二张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202233332.2 产生蛋白质分子嵌合体的策略产生蛋白质分子嵌合体的策略通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接 条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接 条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列
34、条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列通过通过通过通过PCRPCR双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法 该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，将两个编码不同蛋白质的将两个编码不同蛋白质的将两个编码不同蛋白质的将两个编码不同蛋白质的DNADNA分子重组，形成分子重组，形成分子重组，形成分子重组，形成DNADNA分子分子分子分子嵌合体嵌合体嵌合体嵌合体第三十三张，PPT共六
35、十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223434第三十四张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202235353 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接的连接n1990年年Saccharomydes cerevisiae发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质会发生自我剪接（会发生自我剪接（protein splicing），），从而首次发现第一个蛋白质内含子从而首次发现第一个蛋白质内含子Sce VMA n蛋白质内含子蛋白质内含子(intein)是蛋白质是蛋白质中的一段多肽链中
36、的一段多肽链,它靠自我剪切的它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来方式从前体蛋白中分离出来,而两而两端的外显子以肽键的方式相连端的外显子以肽键的方式相连 第三十五张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223636基因融合的用途基因融合的用途上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达表达产物的分离表达产物的分离表达产物的分离表达产物的分离纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位
37、 作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。第三十六张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223737 第三节第三节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在大肠
38、杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达第三十七张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223838 一、大肠杆菌中表达体系的优点一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌(E.coliE.coli)表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。源
39、基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：1 1）遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚；2 2）容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵；3 3）外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达。第三十八张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20223939
40、大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是：大肠杆菌系统最大的不足之处是：（1 1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基，如糖基化、烷基，如糖基化、烷基，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；（2 2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质
41、组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制制制制。（3 3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；（4 4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保而当真核基因在大肠杆菌中表达
42、时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的留在蛋白质的留在蛋白质的留在蛋白质的N N末端末端末端末端。最后，由于真核最后，由于真核最后，由于真核最后，由于真核mRNAmRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核用真核用真核用真核mRNAmRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5 5）有时不能得到足够的有时不能
43、得到足够的有时不能得到足够的有时不能得到足够的产物产物产物产物。第三十九张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224040大肠杆菌表达体系的应用大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的当外源蛋白质的分子量小于分子量小于分子量小于分子量小于70kD70kD,不存在半胱氨酸不存在半胱氨酸不存在半胱氨酸不存在半胱氨酸或或分子内的二硫键少于分子内的二硫键少于3 34 4个个个个，以及，以及，以及，以及不需要翻译后修不需要翻译后修不需要翻译后修不需要翻译后修饰饰饰饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意
44、的结果。肠杆菌系统得到满意的结果。第四十张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202241411表达载体的一般特点表达载体的一般特点(1)(1)复制起始点复制起始点(2)(2)选择性基因选择性基因选择性基因选择性基因 (3)(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列强的转录终止序列(5)核糖体结合位点核糖体结合位点(6)(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点合适的多克隆位点合适的多克隆位点第四十一张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224242(1)复
45、制起始点复制起始点绝大多数载体利用绝大多数载体利用pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的复质粒来源的复制起始点（如，制起始点（如，pET28pET28系列）系列）复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的质粒可保持质粒来源的质粒可保持20502050个个拷贝数和拷贝数和150200150200个拷贝数个拷贝数第四十二张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224343(2)选择性基因选择性基因 载体上要含有至少一个选择性基因载体上要含有至少一个选择性基因作用：作用：1）
46、保证对转化体的筛选）保证对转化体的筛选 2）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失种类：种类：第四十三张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224444(3)(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子原核细胞的启动子包括了原核细胞的启动子包括了RNARNA聚合酶的识别位聚合酶的识别位点和结合位点点和结合位点启动子序列通常包含了启动子序列通常包含了1010区（区（TATAATTATAAT）和）和3535区（区（TTGACATTGACA）常用的种类：常用的种类：LacUV5LacUV5、trptrp、tactac、trct
47、rc以及以及T7T7启启动子动子RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位点第四十四张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224545(4)强的转录终止序列强的转录终止序列 为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件：为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件：转录终止序列转录终止序列抗转录终止序列抗转录终止序列 减少不必需的转录通减少不必需的转录通过复制起始位点，其作用过复制起始位点，其作用可以帮助稳定可以帮助稳定mRNA，增加，增加mRNA的半衰期的半衰期 保证目标保证目标基因完全被基因完全被转录转录第四十五张，PPT
48、共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224646(5)核糖体结合位点核糖体结合位点位置：位于启动子下游，翻译起始密码位置：位于启动子下游，翻译起始密码ATGATG的上的上游游核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列，对原核细胞序列，对原核细胞mRNAmRNA翻翻译起始非常关键译起始非常关键第四十六张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224747(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上用于构建或改造载体用于构建或改造载体用
49、于构建或改造载体用于构建或改造载体第四十七张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.202248482与外源基因有效表达的相关因素与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始有效的转录起始有效的转录起始有效的转录起始(2)有效的翻译有效的翻译有效的翻译有效的翻译(3)(3)蛋白质水解作用蛋白质水解作用蛋白质水解作用蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌蛋白质的外泌 第四十八张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20224949(1)有效的转录起始有效的转录起始转录起始的速率是基因表转录起始的速率是基因表转录起始的速率是基因表转录
50、起始的速率是基因表达的主要限速步骤达的主要限速步骤达的主要限速步骤达的主要限速步骤高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：1 1 1 1）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱 2 2 2 2）调控序列）调控序列）调控序列）调控序列第四十九张，PPT共六十四页，创作于2022年6月19.09.202219.09.20225050(2)有效的翻译有效的翻译mRNAmRNA的稳定性的稳定性翻译起始的频率翻译起始的频率肽链延伸肽链延伸 和终止的速率和终止的速率翻译的忠实性翻译的忠实性mRNAmRNA转录速率越高转录速率越高mRNAmRNA降解速