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1、关于蛋白质的纯化与关于蛋白质的纯化与鉴定鉴定第1页，此课件共110页哦LectureOutlinen n蛋白质的分离纯化的基础n n蛋白质的分离纯化原则和程序n n蛋白质的含量测定n n蛋白质纯度鉴定n n蛋白质的分离纯化方法n n蛋白质层析技术n n蛋白层析的主要技术9/27/20222第2页，此课件共110页哦第七部分蛋白层析的主要技术第3页，此课件共110页哦蛋白层析的主要技术n nGel Filtration Chromatography(GFC)n nIon Exchange Chromatography(IEX or IEC)n nAffinity Chromatography(A
2、C)n nHydrophobic Interaction Chromatography(HIC)9/27/20224第4页，此课件共110页哦I.Gel FiltrationChromatography（GFC）第5页，此课件共110页哦Gel Chromatographyn凝胶过滤 （gel filtration）(Porath,Flodin,1959)n分子筛层析（molecular sieve chromatography）(Hjertn,Mosbach,1962)n排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析
3、柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.第6页，此课件共110页哦1.基本原理2.凝胶层析的数理关系3.凝胶层析的优点4.凝胶层析的缺点5.凝胶介质6.凝胶类型的选择7.其它条件选择Gel filtration第7页，此课件共110页哦一、基本原理 样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应 分子大小不同分子大小不同,在在凝胶受到的阻滞凝胶受
4、到的阻滞作用有差异作用有差异,从而从而造成各组分在凝造成各组分在凝胶柱中的迁移速胶柱中的迁移速度不同得到分度不同得到分离。第8页，此课件共110页哦（一）（一）纯化：纯化：对生物大分子的纯化。如病对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。多糖等。应用：应用：第9页，此课件共110页哦Gel filtration purification of an enzyme:SDS-PAGE analysisM-LMW markers1-Start material2-Pool from ion exchange3-Pool from HIC4-P
5、ool from Superdex 75 pg4321MM67k43k30k第10页，此课件共110页哦（二）分子量的测定：（二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。第11页，此课件共110页哦Highlyefficientdesaltinginlessthan1minute（三）（三）溶液的浓缩溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。小分子被膨胀的凝胶吸收。（四）（四）去除干扰的小分子去除
6、干扰的小分子：脱盐（盐可被看作：脱盐（盐可被看作是小分子）、是小分子）、EDTAEDTA、生物标记等。、生物标记等。10 20 30 40 50 secAlbuminNaCl第12页，此课件共110页哦（五）（五）更换缓冲液更换缓冲液：为接下来的实验：为接下来的实验更换缓冲液体系更换缓冲液体系（六）（六）测定平衡常数测定平衡常数：例如药物的蛋：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，白结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。质，通过凝胶过滤将二者分开。第13页，此课件共110页哦二、凝胶层析的数理关系 1、柱床体积、
7、柱床体积(VT)2、洗脱体积（洗脱体积（Ve）即即欲欲分分离离物物质质通通过过层层析析柱柱洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱液的总体积。脱液的总体积。3、外水体积（外水体积（V0）4、内水体积（内水体积（Vi）5、凝胶干体积（、凝胶干体积（Vg）6、分配系数（、分配系数（Kd）第14页，此课件共110页哦柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶外存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体面空隙之间的水相体积，相应于一般层析积，相应于一般层析法中流动相的体积。法中流动相的体积。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从干凝的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水胶颗粒重量
8、和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内外凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。间隙体积的总和。VT=1/4 D2h外水体积外水体积V0V VT T =Vg+V=Vg+V0 0+Vi+Vi数理关系数理关系VoidvolumeVoVolumeofthegelmatrixVgPorevolumeVi第15页，此课件共110页哦洗脱体积洗脱体积VeVoVeVolumeConcentration第16页，此课件共110页哦Ve-VoVe-Vo Kd=Kd=Vi Vi分配系数（分配系数（Kd）：）：特点：特点：（1）与被分离物质分子）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的的大小和凝胶颗粒孔隙的
9、大小有关大小有关（2）与柱的长短粗细无）与柱的长短粗细无关关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（特定的分配系数（KdKdKdKd）Ve=Vo+KdViVe=Vo+KdViKd is difficult to get because Vi is difficult to measure第17页，此课件共110页哦(3)Ve=Vo+Vi(3)Ve=Vo+Vi Kd=1 Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部完全向凝胶颗粒内部扩散扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出.(1)Ve=Vo(1)
10、Ve=Vo Kd=0 Kd=0n分分子子完完全全被被排排阻阻于凝胶颗粒之外于凝胶颗粒之外n全全部部分分布布于于流流动相里动相里,n最先流出。最先流出。(2)0 Kd 1 Ve(2)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKd=Vo+ViKdn为溶质以某种程度为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散向凝胶颗粒内扩散 Kd=0Kd=0Kd=0Kd=0 0 0 0 0Kd1Kd1Kd1Kd1 Kd=1Kd=1Kd=1Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积第18页，此课件共110页哦三三.凝胶层析的优点凝胶层析的优点 1.1.凝凝胶胶是是一一种种不不带带电电荷荷的的惰惰性性载载体体，结结构构稳稳定定。凝胶本身不与样品
11、发生化学反应。凝胶本身不与样品发生化学反应。2.2.操操作作条条件件较较温温和和。用用来来分分离离一一些些理理化化性性质质不不稳定的物质。稳定的物质。3.3.样样品品得得率率高高,重重复复性性好好,可可进进行行大大量量样样品品的的分分离纯化。离纯化。4.4.最快的更换缓冲液最快的更换缓冲液第19页，此课件共110页哦四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点1.1.要求要求样品和洗脱液的样品和洗脱液的粘度粘度很低很低。2.2.凝凝胶胶颗颗粒粒网网络络孔孔径径大大小小非非常常有有限限,所所以以可被纯化的物质的可被纯化的物质的分子量范围受到限制分子量范围受到限制。3.3.凝凝胶胶结结构构对对某某些些溶溶
12、质质分分子子具具有有吸吸附附作作用用。如芳香族化合物与脂蛋白等。如芳香族化合物与脂蛋白等。第20页，此课件共110页哦n葡聚糖（glucose）n琼脂糖（agarose）n聚丙烯酰胺（acrylamide）n纤维素（cellulose）五、凝胶介质五、凝胶介质第21页，此课件共110页哦 19591959年年PorathPorathPorathPorath和和FlodinFlodinFlodinFlodin合成合成合成合成（商品名为（商品名为SephadexSephadexSephadexSephadex）（1 1）结构：）结构：基本骨架：基本骨架：葡聚糖（葡聚糖（dextrandextran
13、dextrandextran）交联剂：交联剂：3-3-3-3-氯代氯代-1,2-1,2-1,2-1,2-环氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的聚合而成的聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构。1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶第22页，此课件共110页哦（2）特点：交联度：交联度：交交联联剂剂越越多多，交交联联度度越越大大，网网孔孔结结构构越越紧紧密密。孔孔隙隙愈愈小小，吸吸水水后后膨膨胀胀也也愈愈小小，机机械械强强度度高高，分分离离物物质质的的分分子子量量也也小小。反反之之,交交联联剂剂的的百百分分比比低低，分分离物质的分子量大
14、。离物质的分子量大。化学性质：化学性质：稳稳定定,不不溶溶于于水水、盐盐、弱弱酸酸、碱碱和和一一般般有有机机溶溶剂剂,耐热耐碱不耐强酸耐热耐碱不耐强酸第23页，此课件共110页哦SephadexSephadex的分级范围的分级范围 G10 700G10 700G10 700G10 700G15 1,500G15 1,500G15 1,500G15 1,500G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G50 1,50030,000G50 1,50030,000G75 3,00070,000G75 3,00070,000
15、G75 3,00070,000G75 3,00070,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000吸水性吸水性n nG类的型号类的型号表示每克干凝胶吸水表示每克干凝胶吸水量（量（ml）x10如如G-50每克干凝胶吸水每克干凝胶吸水量为量为5ml。第24页，此课件共110页哦n
16、n由由琼琼脂脂制制成成的的线线性性多多糖糖，由由D-半半乳乳糖糖和和3 3，6-脱脱水水L-半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。n n大大大大孔孔孔孔凝凝凝凝胶胶胶胶，工工作作范范围围的的下下限限几几乎乎是是 Sephadex的的上上限限，可可分分离离MW40MW40万万万万以以以以上上上上的的物物质质，可可用用来来分分离离核核酸酸及及病毒病毒n n琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解n n对实验条件要求高对实验条件要求高(温度温度温度温度40
17、40,pH=4.5-9.0),pH=4.5-9.0)2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose，Biogel-A)第25页，此课件共110页哦型号型号近似的琼脂糖浓度近似的琼脂糖浓度(%)多糖多糖蛋白质蛋白质Sepharose 2B220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106第26页，此课件共110页哦n n是是一一种种人人工工合合成成凝凝胶胶，是是以以丙丙烯烯酰酰胺胺为为单单位位，由由甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺交交联联成成的的，经经干干燥燥粉粉碎碎或或加加工工成成形形制制成粒状，控制交联剂的用量可制成
18、各种型号的凝胶。成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。n n使使用用范范围围及及效效果果同同葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶相相似似，但但化化学学性性质质较较葡聚糖稳定，可在葡聚糖稳定，可在pH 2-11pH 2-11范围内使用范围内使用.3 3、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶第27页，此课件共110页哦各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose第28页，此课件共110页哦 1.组分离
19、：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐Sephadex G-25。2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl S-200 superfine,Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。六、凝胶类型的选择六、凝胶类型的选择第29页，此课件共110页哦七.其它条件选择 1.柱的选择柱的选择 长的的层层析析柱柱分分辨辨率率要
20、要比比短短的的高高。但但层层析析柱柱长长度度不不能能过过长长，否否则则会会引引起起柱柱子子不不均均一一、流流速速过过慢慢等等实实验验上上的的一一些些困困难难。一一般般柱柱长长度度不不超超过过1m，为为得得到到高高分分辨辨率率，可可以以将将柱柱子子串串联使用。联使用。2.2.样品的选择：样品体积占床体积的1-5%,1-5%,粘度小粘度小。3.洗脱液的选择：完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液，最重要的要考虑、磷酸盐缓冲液，最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如洗脱液对样品的作用，如pH、离子强度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性
21、。第30页，此课件共110页哦 八、凝胶过滤的实验八、凝胶过滤的实验（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备 Sephadex Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的
22、时间不同：G-25,G-50 G-25,G-50 膨胀过夜膨胀过夜膨胀过夜膨胀过夜 G-75 G-75 一天一天一天一天 G-100 G-100 二天二天二天二天 G-200 G-200 三天三天三天三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。Sephacryl,Sepharose,Sepharose CLSephacryl,Sepharose,Sepharose CL是膨胀好的。是膨胀好的。是膨胀好的。是膨胀好的。第31页，此课件共110页哦 （二）、装柱（二）、装柱（二）、装柱
23、（二）、装柱1.1.将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约75%75%。2.2.用负压泵脱气。用负压泵脱气。用负压泵脱气。用负压泵脱气。3.3.如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。4.4.层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。5.5.排掉层析床支持物内的气
24、体。排掉层析床支持物内的气体。排掉层析床支持物内的气体。排掉层析床支持物内的气体。6.6.层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。7.7.凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。第32页，此课件共110页哦 （三）、检查层析柱（三）、检查层析柱（三）、检查层析柱（三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖20002000（2mg/ml2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时移）为样品，观察色带在柱内洗脱时移）为样品，观察色带在柱内洗脱时移）为
25、样品，观察色带在柱内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。（四）、加样（四）、加样（四）、加样（四）、加样 1.1.手工加样手工加样手工加样手工加样 2.2.加样阀加样加样阀加样加样阀加样加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。（五）、洗脱（五）、洗脱（五）、洗脱（五）、洗脱 洗脱装置用蠕
26、动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到
27、上面，影响分离凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需清洗后才能恢复原样。效果，需清洗后才能恢复原样。效果，需清洗后才能恢复原样。效果，需清洗后才能恢复原样。Sephadex,Sephadex,，SepacrylSepacryl，Sepharose CL Sepharose CL 可用可用可用可用0.2M NaOH0.2M NaOH。Sepharose Sepharose 可用可用可用可用4pH94pH9缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。第33页，此课件共110页哦 (七七七七)、凝胶的储存和防止微生物生长、凝胶的储存和防止
28、微生物生长、凝胶的储存和防止微生物生长、凝胶的储存和防止微生物生长 使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生长，抗菌剂必须不与样品作用。长，抗菌剂必须不与样品作用。长，抗菌剂必须不与样
29、品作用。长，抗菌剂必须不与样品作用。通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠 0.02%0.02%，三氯丁醇，三氯丁醇，三氯丁醇，三氯丁醇 0.05%0.05%，硫柳，硫柳，硫柳，硫柳汞汞汞汞 0.005%0.005%，洗必太，洗必太，洗必太，洗必太 0.002%0.002%，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸:硝酸）硝酸）硝酸）硝酸）0.001-0.001-0.01%0.01%。Sephadex,Sephadex,，Sephacryl,Sephacryl,，SepharoseSepharose和和和和Sepharos
30、e CLSepharose CL都可以在都可以在都可以在都可以在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在4 4冷藏，但要防止冻结，因为冷藏，但要防止冻结，因为冷藏，但要防止冻结，因为冷藏，但要防止冻结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。冻结将破坏凝胶颗粒。冻结将破坏凝胶颗粒。冻结将破坏凝胶颗粒。SephadexSephadex可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和杂
31、质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用96%96%乙醇，使胶皱缩，乙醇，使胶皱缩，乙醇，使胶皱缩，乙醇，使胶皱缩，布氏漏斗抽虑，布氏漏斗抽虑，布氏漏斗抽虑，布氏漏斗抽虑，60-8060-80烘干。烘干。烘干。烘干。第34页，此课件共110页哦II.Ion Exch
32、ange ChromatographyUseful at all stages of purification and at all scales第35页，此课件共110页哦1.基本原理2.离子交换剂的类型3.离子交换剂与缓冲液的选择 4.应用5.离子交换层析的优点Ion Exchange Chromatography第36页，此课件共110页哦一、原理用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。第37页，此课件共110页哦低盐高盐分离结束第38页，此课件共110页哦带电荷不同蛋白在特定不同蛋白在特定pH值下有不同带
33、电性质值下有不同带电性质第39页，此课件共110页哦离子交换树脂如何分离蛋白质离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第40页，此课件共110页哦二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离离子子交交换树脂稳定。换树脂稳定。胶体胶体第41页，此课件共110页哦阳离子交
34、换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂第42页，此课件共110页哦阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素第43页，此课件共110页哦 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子商品名商品名纤维素纤维素 OOCHCH2 2COOCOO-Na+CM-CM-纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素-O-O-O-O-（CHCHCHCH2 2 2 2）2 2 2 2-N N+H H（C C C C2 2 2 2H H H H5 5 5 5）
35、2 2 2 2 ClCl-DEAE-DEAE-纤维素纤维素纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯SO3 3-Na+732阳离子树脂阳离子树脂 聚苯乙烯聚苯乙烯N N+（CH2）4 4 ClCl-717阴离子树脂阴离子树脂第44页，此课件共110页哦n离子交换树脂n离子交换纤维素n离子交换凝胶（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同第45页，此课件共110页哦1.1.离子交换树脂：离子交换树脂：聚苯乙烯树脂：苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体交联剂交联剂第46页，此课件共110页哦离子交换树脂的性质离子交换树脂的性质1 1、一般离子交换剂的特性、一般离子交换剂的特性 多孔性：疏松、多孔网
36、状，活性基团在网孔多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内内 不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂 稳定性：稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团团第47页，此课件共110页哦Dowex 100 149 m Dowex 50 297 mDowex 20 840 m 2 2、交联度：、交联度：合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少交联度越小 树脂的网孔越大 膨胀性大 交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损第48页，此课件共110页哦阳离子交换树脂阳离子交换
37、树脂 强酸型强酸型 磺酸基磺酸基 -SO3-H+中等酸型中等酸型 磷酸根磷酸根 -O-PO2H2亚磷酸根亚磷酸根-O-POH2 弱酸型弱酸型 羧基羧基 -COOH-COOH阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 季胺基团季胺基团 -N+(CH3)3 弱碱弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团叔胺、仲胺、伯胺基团 可引入的解离基团可引入的解离基团第49页，此课件共110页哦操作过程：操作过程：1.装柱；2.离子交换；3.洗脱第50页，此课件共110页哦三、离子交换剂与缓冲液的选择三、离子交换剂与缓冲液的选择（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择必须考虑的影响因素必须考虑的影响因素 1阴、阳离子交换剂的
38、选择2强、弱离子交换剂的选择3不同离子型交换剂的选择4不同基质离子交换剂的选择第51页，此课件共110页哦阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择n测定测定pIpIn n确定稳定确定稳定pHpH范围范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG第52页，此课件共110页哦离子交换剂的选择图离子交换剂的选择图第53页，此课件共110页哦不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱
39、性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。第54页，此课件共110页哦不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择1.1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素第55页，此课件共110页哦1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择第56页，此课件共110页哦1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 要求：起始缓冲液能使样品中有效成分与离子
40、交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。pH值与目标物pI的关系（pH=pI1）选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；第57页，此课件共110页哦2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。第58页，此课件共110页哦3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与
41、与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂结结结结合，一般小于合，一般小于合，一般小于合，一般小于0.1 mol/L0.1 mol/L。洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上解解解解离离离离下下下下来来来来，一般一般一般一般0.15 mol/L0.15 mol/L0.15 mol/L0.15 mol/L（或采用（或采用（或采用（或采用pHpH洗脱）。洗脱）。洗脱）。洗脱）。第59页，此课件共110页哦 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力
42、降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱(三三)洗脱剂的选择洗脱剂的选择第60页，此课件共110页哦四、应用 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及他带电的生物分子。第61页，此课件共110页哦五、离子交换层析的优点五、离子交换层析的优点n n应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电。n n处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。n n去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除。n n分离能力强。n n可放在纯化工艺的任何一步。第62页，此课件共110页哦III.Affinity Chromatography(AC)亲 和 层 析第63页，此
43、课件共110页哦亲和层析ACAffinity chromatography is a technique of liquid chromatography which separates biomolecules through biospecific interactions.1.基本原理2.分离过程3.特点4.应用第64页，此课件共110页哦一、原理n生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。n亲和层析通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。第65页，此课件共110页哦
44、酶：酶：酶：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗体：抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞细胞：细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合结合结合结合 蛋白蛋白蛋白蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，
45、细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞具有专一性亲和力的生物分子对具有专一性亲和力的生物分子对第66页，此课件共110页哦Definitions in Affinity Chromatographyn nMatrix Matrix(基质或载体基质或载体):an inert gel to which a ligand can be coupled:an inert gel to which a ligand can be coupledn nLiganLigand(d(配基配基):a component which interacts specifically with
46、the target:a component which interacts specifically with the targetn nCoupling(Coupling(偶联偶联):covalent attachment of the ligand to the matrix):covalent attachment of the ligand to the matrixn nBinding(Binding(结合结合):association between the ligand and the target):association between the ligand and the
47、 targetMatrixSpecific ligand第67页，此课件共110页哦第68页，此课件共110页哦（一）载体的选择1 1、载体要求：、载体要求：（1 1）不溶性）不溶性（2 2）渗渗透透性性：疏疏松松网网状状结结构构，有有良良好好的的液液体体流动性流动性（3 3）化学和机械性能稳定）化学和机械性能稳定（4 4）具备大量能被活化的基因）具备大量能被活化的基因（5 5）抗微生物和酶的侵蚀）抗微生物和酶的侵蚀第69页，此课件共110页哦2 2、常用载体、常用载体（1 1）纤维素）纤维素 特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入纤维性、非均一性限制大分子
48、的掺入 非专一性吸附严重非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化用于抗体和酶的纯化（2 2）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶 特点：特点：化学及物理性质稳定化学及物理性质稳定 多孔性比琼脂糖低多孔性比琼脂糖低第70页，此课件共110页哦 （3 3）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶浓度浓度 商品商品2 2 Sepharose 2B Sepharose 2B 4%Sepharose 4B 4%Sepharose 4B 6%Sepharose 6B6%Sepharose 6B 凝胶浓度越低凝胶浓度越低结构越疏松即多孔性越高结构越疏松即多孔性越高机械强度越低机械强度越低第71页，此课件共110页哦（4 4）聚丙烯酰胺凝胶）聚
49、丙烯酰胺凝胶（5 5）多孔玻璃）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀特点：不受微生物的侵蚀 耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附特点：物理化学性质稳定特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的可供化学反应的酰胺基较多酰胺基较多酰胺基较多酰胺基较多第72页，此课件共110页哦（二）配基的选择（二）配基的选择1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被修饰的功能基团3、配基偶联的位置，需不影响与大分子连接的部位。4、亲和柱制备首选大分子配基。第7
50、3页，此课件共110页哦以酶和底物为例：以酶和底物为例：E+L ELE+L ELE+L ELE+L ELK K K KL L=EL/EL=E=EL/EL=E0 0 0 0-ELL-ELL0 0 0 0-EL/EL-EL/EL-EL/EL-EL/ELE E E E0 0、L L L L0 0：起始浓度：起始浓度：起始浓度：起始浓度当当当当L L L L0 0E E E E0 0 0 0时时K K K KL L=E=E=E=E0 0 0 0-E-EL LLL0 0 0 0/E/E/E/EL L L L EL=EEL=EEL=EEL=E0 0 0 0-E-EL L L LLL0 0/K/KL L L