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1、关于蛋白质的纯化与关于蛋白质的纯化与鉴定鉴定第1页，讲稿共110张，创作于星期三LectureOutlinen n蛋白质的分离纯化的基础n n蛋白质的分离纯化原则和程序n n蛋白质的含量测定n n蛋白质纯度鉴定n n蛋白质的分离纯化方法n n蛋白质层析技术n n蛋白层析的主要技术10/16/20222第2页，讲稿共110张，创作于星期三第七部分蛋白层析的主要技术第3页，讲稿共110张，创作于星期三蛋白层析的主要技术n nGel Filtration Chromatography(GFC)n nIon Exchange Chromatography(IEX or IEC)n nAffinity
2、Chromatography(AC)n nHydrophobic Interaction Chromatography(HIC)10/16/20224第4页，讲稿共110张，创作于星期三I.Gel FiltrationChromatography（GFC）第5页，讲稿共110张，创作于星期三Gel Chromatographyn凝胶过滤 （gel filtration）(Porath,Flodin,1959)n分子筛层析（molecular sieve chromatography）(Hjertn,Mosbach,1962)n排阻层析 （exclusion chromatography）(Pe
3、dersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.第6页，讲稿共110张，创作于星期三1.基本原理2.凝胶层析的数理关系3.凝胶层析的优点4.凝胶层析的缺点5.凝胶介质6.凝胶类型的选择7.其它条件选择Gel filtration第7页，讲稿共110张，创作于星期三一、基本原理 样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出
4、 分子筛效应分子筛效应 分子大小不同分子大小不同,在凝胶受到的阻在凝胶受到的阻滞作用有差异滞作用有差异,从从而造成各组分在而造成各组分在凝胶柱中的迁移凝胶柱中的迁移速度不同得到分速度不同得到分离。第8页，讲稿共110张，创作于星期三（一）（一）纯化：纯化：对生物大分子的纯化。如病对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。多糖等。应用：应用：第9页，讲稿共110张，创作于星期三Gel filtration purification of an enzyme:SDS-PAGE analysisM-LMW markers1-Start mat
5、erial2-Pool from ion exchange3-Pool from HIC4-Pool from Superdex 75 pg4321MM67k43k30k第10页，讲稿共110张，创作于星期三（二）分子量的测定：（二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。第11页，讲稿共110张，创作于星期三Highlyefficientdesaltinginlessthan1minute（三）（三）溶液的浓缩溶液的浓缩：加入干胶
6、，溶液的水和：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。小分子被膨胀的凝胶吸收。（四）（四）去除干扰的小分子去除干扰的小分子：脱盐（盐可被看作：脱盐（盐可被看作是小分子）、是小分子）、EDTAEDTA、生物标记等。、生物标记等。10 20 30 40 50 secAlbuminNaCl第12页，讲稿共110张，创作于星期三（五）（五）更换缓冲液更换缓冲液：为接下来的实验更：为接下来的实验更换缓冲液体系换缓冲液体系（六）（六）测定平衡常数测定平衡常数：例如药物的蛋白：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，与蛋结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通白结合后成为分子量
7、较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。过凝胶过滤将二者分开。第13页，讲稿共110张，创作于星期三二、凝胶层析的数理关系 1、柱床体积、柱床体积(VT)2、洗脱体积（洗脱体积（Ve）即即欲欲分分离离物物质质通通过过层层析析柱柱洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱脱液的总体积。液的总体积。3、外水体积（外水体积（V0）4、内水体积（内水体积（Vi）5、凝胶干体积（、凝胶干体积（Vg）6、分配系数（、分配系数（Kd）第14页，讲稿共110张，创作于星期三柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水外面空隙之间的水相体积，相应于一相体积，相
8、应于一般层析法中流动相般层析法中流动相的体积。的体积。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从干凝的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水胶颗粒重量和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。外间隙体积的总和。VT=1/4 D2h外水体积外水体积V0V VT T =Vg+V=Vg+V0 0+Vi+Vi数理关系数理关系VoidvolumeVoVolumeofthegelmatrixVgPorevolumeVi第15页，讲稿共110张，创作于星期三洗脱体积洗脱体积VeVoVeVolumeConcentration第16页，讲稿共110张，创作于星期三Ve-V
9、oVe-Vo Kd=Kd=Vi Vi分配系数（分配系数（Kd）：）：特点：特点：（1）与被分离物质分）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关隙的大小有关（2）与柱的长短粗细无）与柱的长短粗细无关关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（特定的分配系数（特定的分配系数（特定的分配系数（KdKdKdKd）Ve=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdViKd is difficult to get because
10、 Vi is difficult to measure第17页，讲稿共110张，创作于星期三(3)Ve=Vo+Vi(3)Ve=Vo+Vi Kd=1 Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部完全向凝胶颗粒内部扩散扩散n在两相分配的比值在两相分配的比值为为1,1,最后流出最后流出.(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo Kd=0 Kd=0n分分子子完完全全被被排排阻阻于于凝凝胶胶颗颗粒粒之之外外n全全部部分分布布于于流流动相里动相里,n最先流出。最先流出。(2)0 Kd 1 (2)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKdn为溶质以某种程度为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩
11、散向凝胶颗粒内扩散 Kd=0Kd=0Kd=0Kd=0 0 0 0 0Kd1Kd1Kd1Kd1 Kd=1Kd=1Kd=1Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积第18页，讲稿共110张，创作于星期三三三.凝胶层析的优点凝胶层析的优点 1.1.凝凝胶胶是是一一种种不不带带电电荷荷的的惰惰性性载载体体，结结构构稳稳定定。凝胶本身不与样品发生化学反应。凝胶本身不与样品发生化学反应。2.2.操操作作条条件件较较温温和和。用用来来分分离离一一些些理理化化性性质质不稳定的物质。不稳定的物质。3.3.样样品品得得率率高高,重重复复性性好好,可可进进行行大大量量样样品品的的分分离离纯化。纯化。4.4.最快的更换
12、缓冲液最快的更换缓冲液第19页，讲稿共110张，创作于星期三四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点1.1.要求要求样品和洗脱液的样品和洗脱液的粘度粘度很低很低。2.2.凝凝胶胶颗颗粒粒网网络络孔孔径径大大小小非非常常有有限限,所所以以可被纯化的物质的可被纯化的物质的分子量范围受到限制分子量范围受到限制。3.3.凝凝胶胶结结构构对对某某些些溶溶质质分分子子具具有有吸吸附附作作用用。如芳香族化合物与脂蛋白等。如芳香族化合物与脂蛋白等。第20页，讲稿共110张，创作于星期三n葡聚糖（glucose）n琼脂糖（agarose）n聚丙烯酰胺（acrylamide）n纤维素（cellulose）五、凝胶介质
13、五、凝胶介质第21页，讲稿共110张，创作于星期三 1959195919591959年年年年PorathPorathPorathPorath和和和和FlodinFlodinFlodinFlodin合成合成合成合成（商品名为（商品名为（商品名为（商品名为SephadexSephadexSephadexSephadex）（1 1 1 1）结构：）结构：）结构：）结构：基本骨架：基本骨架：基本骨架：基本骨架：葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（dextrandextrandextrandextran）交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：3-3-3-3-氯代氯代氯代氯代-1,2-1,2-1,2-1,2-环氧氯
14、丙环氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的聚合而成的聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构。1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶第22页，讲稿共110张，创作于星期三（2）特点：交联度：交联度：交交联联剂剂越越多多，交交联联度度越越大大，网网孔孔结结构构越越紧紧密密。孔孔隙隙愈愈小小，吸吸水水后后膨膨胀胀也也愈愈小小，机机械械强强度度高高，分分离离物物质质的的分分子子量量也也小小。反反之之,交交联联剂剂的的百百分分比低，分离物质的分子量大。比低，分离物质的分子
15、量大。化学性质：化学性质：稳稳定定,不不溶溶于于水水、盐盐、弱弱酸酸、碱碱和和一一般般有有机机溶溶剂剂,耐热耐碱不耐强酸耐热耐碱不耐强酸第23页，讲稿共110张，创作于星期三SephadexSephadex的分级范围的分级范围 G10 700G10 700G10 700G10 700G15 1,500G15 1,500G15 1,500G15 1,500G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G50 1,50030,000G50 1,50030,000G50 1,50030,000G50 1,50030,000G7
16、5 3,00070,000G75 3,00070,000G75 3,00070,000G75 3,00070,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000吸水性吸水性n nG类的型号类的型号表示每克干凝胶吸
17、表示每克干凝胶吸水量（水量（ml）x10如如G-50每克干凝胶吸水每克干凝胶吸水量为量为5ml。第24页，讲稿共110张，创作于星期三n n由由由由琼琼琼琼脂脂脂脂制制制制成成成成的的的的线线线线性性性性多多多多糖糖糖糖，由由由由D-D-半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖和和和和3 3，6-6-脱脱脱脱水水水水L-L-半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。半乳糖交替组成。n n大大大大孔孔孔孔凝凝凝凝胶胶胶胶，工工工工作作作作范范范范围围围围的的的的下下下下限限限限几几几几乎乎乎乎是是是是 SephadexSephadex的的的的上上上上限限限限，可可可可分分分分离离离离MW40MW40万万万
18、万以以以以上上上上的的的的物物物物质质质质，可可可可用用用用来来来来分分分分离离离离核核核核酸酸酸酸及及及及病病病病毒毒毒毒n n琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解n n对实验条件要求高对实验条件要求高对实验条件要求高对实验条件要求高(温度温度温度温度4040,pH=4.5-9.0),pH=4.5-9.0)2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose，Biogel-A)第25页，讲稿共110张，创作于星期三型号型号近似的琼脂糖浓度近似的琼脂糖浓度(%)
19、多糖多糖蛋白质蛋白质Sepharose 2B220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106第26页，讲稿共110张，创作于星期三n n是是是是一一一一种种种种人人人人工工工工合合合合成成成成凝凝凝凝胶胶胶胶，是是是是以以以以丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺为为为为单单单单位位位位，由由由由甲甲甲甲叉叉叉叉双双双双丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺交交交交联联联联成成成成的的的的，经经经经干干干干燥燥燥燥粉粉粉粉碎碎碎碎或或或或加加加加工工工工成成成成形形形形制制制制成成成成粒粒粒粒状状状状，控控控控制制制制交交交交联联联联剂剂剂
20、剂的的的的用用用用量量量量可可可可制制制制成成成成各各各各种种种种型型型型号号号号的的的的凝凝凝凝胶。胶。胶。胶。n n使使使使用用用用范范范范围围围围及及及及效效效效果果果果同同同同葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶相相相相似似似似，但但但但化化化化学学学学性性性性质质质质较较较较葡葡葡葡聚聚聚聚糖稳定，可在糖稳定，可在糖稳定，可在糖稳定，可在pH 2-11pH 2-11pH 2-11pH 2-11范围内使用范围内使用范围内使用范围内使用.3 3、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶第27页，讲稿共110张，创作于星期三各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSep
21、hacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose第28页，讲稿共110张，创作于星期三 1.组分离组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（VoVo），低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐Sephadex G-25Sephadex G-25。2.分级分离分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，避免：当分离几种分子量接近的组分时，避免几种成分的洗脱体积接近几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。3.分子量测定：要使样品
22、分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl Sephacryl S-200 superfine,Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。六、凝胶类型的选择六、凝胶类型的选择第29页，讲稿共110张，创作于星期三七.其它条件选择 1.1.柱的选择柱的选择 长长的的层层析析柱柱分分辨辨率率要要比比短短的的高高。但但层层析析柱柱长长度度不不能能过过长长，否否则则会会引引起起柱柱子子不不均均一一、流流速速过过慢慢等等实实验验上上的的一一些些困困难难。一一般般柱柱长长度度不不超超过过1m1m，为为得得到到高高分分辨辨率
23、率，可可以以将将柱柱子子串串联使用。联使用。2.2.样品的选择：样品的选择：样品体积占床体积的样品体积占床体积的1-5%,1-5%,粘度小粘度小。3.3.洗脱液的选择：洗脱液的选择：完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷的物完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷的物质可以用质可以用Tris-HClTris-HCl、磷酸盐缓冲液，最重要的要考虑洗、磷酸盐缓冲液，最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如脱液对样品的作用，如pHpH、离子强度、清洁剂等，是、离子强度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性。否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性。第30页，讲稿共110张，创作
24、于星期三 八、凝胶过滤的实验八、凝胶过滤的实验（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备 Sephadex Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：G-25,G
25、-50 G-25,G-50 膨胀过夜膨胀过夜膨胀过夜膨胀过夜 G-75 G-75 一天一天一天一天 G-100 G-100 二天二天二天二天 G-200 G-200 三天三天三天三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。Sephacryl,Sepharose,Sepharose CLSephacryl,Sepharose,Sepharose CL是膨胀好的。是膨胀好的。是膨胀好的。是膨胀好的。第31页，讲稿共110张，创作于星期三 （二）、装柱（二）、装柱（二）、装柱（二）、装柱
26、1.1.将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约75%75%。2.2.用负压泵脱气。用负压泵脱气。用负压泵脱气。用负压泵脱气。3.3.如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。4.4.层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。5.5.排掉层析床支持物内的气体。排掉层析
27、床支持物内的气体。排掉层析床支持物内的气体。排掉层析床支持物内的气体。6.6.层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。7.7.凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。第32页，讲稿共110张，创作于星期三 （三）、检查层析柱（三）、检查层析柱（三）、检查层析柱（三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖20002000（2mg/ml2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时）为样品，观察色带在柱内洗脱时）为样品，观察色带在柱内洗脱时）为样品，观
28、察色带在柱内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。积。积。积。（四）、加样（四）、加样（四）、加样（四）、加样 1.1.手工加样手工加样手工加样手工加样 2.2.加样阀加样加样阀加样加样阀加样加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。（五）、洗脱（五）、洗脱（五）、洗脱（五）、洗脱 洗脱装置用蠕动
29、泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，凝胶在使用数次后，一些杂
30、质会吸附到上面，影响分离效果，凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需清洗后才能恢复原样。需清洗后才能恢复原样。需清洗后才能恢复原样。需清洗后才能恢复原样。Sephadex,Sephadex,，SepacrylSepacryl，Sepharose CL Sepharose CL 可用可用可用可用0.2M NaOH0.2M NaOH。Sepharose Sepharose 可用可用可用可用4pH94pH9缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。缓冲液及非离子清洁剂。第33页，讲稿共110张，创作于星期三 (七七七七)、凝胶的储存和防止微生物生长、凝胶的储
31、存和防止微生物生长、凝胶的储存和防止微生物生长、凝胶的储存和防止微生物生长 使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生长，抗菌剂必须不与样品作用。生长，抗菌剂必须不与样品作用。生长，抗菌剂必须
32、不与样品作用。生长，抗菌剂必须不与样品作用。通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠通常用的防腐剂有：叠氮钠 0.02%0.02%，三氯丁醇，三氯丁醇，三氯丁醇，三氯丁醇 0.05%0.05%，硫柳汞，硫柳汞，硫柳汞，硫柳汞 0.005%0.005%，洗必太，洗必太，洗必太，洗必太 0.002%0.002%，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸，汞苯盐（乙酸:硝酸）硝酸）硝酸）硝酸）0.001-0.01%0.001-0.01%。Sephadex,Sephadex,，Sephacryl,Sephacryl,，SepharoseSepharose和和和和Seph
33、arose CLSepharose CL都可以在都可以在都可以在都可以在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在4 4冷藏，但要防止冻冷藏，但要防止冻冷藏，但要防止冻冷藏，但要防止冻结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。SephadexSephadex可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和
34、杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用96%96%乙醇，使胶皱乙醇，使胶皱乙醇，使胶皱乙醇，使胶皱缩，布氏漏斗抽虑，缩，布氏漏斗抽虑，缩，布氏漏斗抽虑，缩，布氏漏斗抽虑，60-8060-80烘干。烘干。烘干。烘干。第34页，讲稿共110张，创作于星期三II
35、.Ion Exchange ChromatographyUseful at all stages of purification and at all scales第35页，讲稿共110张，创作于星期三1.基本原理2.离子交换剂的类型3.离子交换剂与缓冲液的选择 4.应用5.离子交换层析的优点Ion Exchange Chromatography第36页，讲稿共110张，创作于星期三一、原理用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。第37页，讲稿共110张，创作于星期三低盐高盐分离结束第38页，讲稿共110张，创作
36、于星期三带电荷不同蛋白在特定不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质值下有不同带电性质第39页，讲稿共110张，创作于星期三离子交换树脂如何分离蛋白质离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第40页，讲稿共110张，创作于星期三二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离
37、离子子交换树脂稳定。交换树脂稳定。胶体胶体第41页，讲稿共110张，创作于星期三阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂第42页，讲稿共110张，创作于星期三阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素第43页，讲稿共110张，创作于星期三 基质基质基质基质 电荷基团电荷基团电荷基团电荷基团 反离子反离子反离子反离子商品名商品名商品名商品名纤维素纤维素纤维素纤维素 OOCHCH2 2COOCOO-NaNa+CM-CM-纤维素
38、纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素-O-O-O-O-（CHCHCHCH2 2 2 2）2 2 2 2-N N+H H H H（C C C C2 2 2 2H H H H5 5 5 5）2 2 2 2 ClCl-DEAE-DEAE-纤维素纤维素纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯SOSO3 3 3 3-NaNa+732732阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂 聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯N N+（CHCH2 2）4 4 4 4 ClCl-717717阴离子树脂阴离子树脂阴离子树脂阴离子树脂第44页，讲稿共110张，创作于星期三n离子交换树脂n离子交换纤维素n离子交换凝胶
39、（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同第45页，讲稿共110张，创作于星期三1.1.离子交换树脂：离子交换树脂：聚苯乙烯树脂：苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体母体母体交联剂交联剂交联剂交联剂第46页，讲稿共110张，创作于星期三离子交换树脂的性质离子交换树脂的性质1 1、一般离子交换剂的特性、一般离子交换剂的特性 多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内孔内 不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂 稳定性：稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团基团第47页，讲稿
40、共110张，创作于星期三Dowex 100 149 m Dowex 50 297 mDowex 20 840 m 2 2、交联度：、交联度：合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少交联度越小交联度越小 树脂的网孔越大树脂的网孔越大 膨胀性大膨胀性大 交换量大交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损第48页，讲稿共110张，创作于星期三阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸型强酸型 磺酸基磺酸基 -SO3-H+中等酸型中等酸型 磷酸根磷酸根 -O-PO2H2亚磷酸根亚磷酸根-O-POH2 弱酸型弱酸型 羧基羧
41、基 -COOH-COOH阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 季胺基团季胺基团 -N+(CH3)3 弱碱弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团叔胺、仲胺、伯胺基团 可引入的解离基团可引入的解离基团第49页，讲稿共110张，创作于星期三操作过程：操作过程：1.装柱；2.离子交换；3.洗脱第50页，讲稿共110张，创作于星期三三、离子交换剂与缓冲液的选择三、离子交换剂与缓冲液的选择（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择必须考虑的影响因素必须考虑的影响因素 1阴、阳离子交换剂的选择2强、弱离子交换剂的选择3不同离子型交换剂的选择4不同基质离子交换剂的选择第51页，讲稿共110张，创作于星期三阴、阳离子交
42、换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择n n测定测定pIpIn n确定稳定确定稳定pHpH范围范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG第52页，讲稿共110张，创作于星期三离子交换剂的选择图离子交换剂的选择图第53页，讲稿共110张，创作于星期三不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。第54页，讲稿共110张，创作于星期三不同基质离子交换剂
43、的选择不同基质离子交换剂的选择1.1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素第55页，讲稿共110张，创作于星期三1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择第56页，讲稿共110张，创作于星期三1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 要求：起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。pH值与目
44、标物pI的关系（pH=pI1）选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；第57页，讲稿共110张，创作于星期三2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。第58页，讲稿共110张，创作于星期三3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂
45、结合，一般小于结合，一般小于结合，一般小于结合，一般小于0.1 mol/L0.1 mol/L0.1 mol/L0.1 mol/L。洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上解解解解离离离离下下下下来来来来，一般一般一般一般0.15 mol/L0.15 mol/L0.15 mol/L0.15 mol/L（或采用（或采用（或采用（或采用pHpHpHpH洗脱）。洗脱）。洗脱）。洗脱）。第59页，讲稿共110张，创作于星期三 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂
46、的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱(三三)洗脱剂的选择洗脱剂的选择第60页，讲稿共110张，创作于星期三四、应用 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及他带电的生物分子。第61页，讲稿共110张，创作于星期三五、离子交换层析的优点五、离子交换层析的优点n n应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电。n n处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。n n去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除。n n分离能力强。n n可放在纯化工艺的任何一步。第62页，讲稿共110张，创作于星期三III.Affinity Chromatogra
47、phy(AC)亲 和 层 析第63页，讲稿共110张，创作于星期三亲和层析ACAffinity chromatography is a technique of liquid chromatography which separates biomolecules through biospecific interactions.1.基本原理2.分离过程3.特点4.应用第64页，讲稿共110张，创作于星期三一、原理n n生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。n n亲和层析通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特
48、异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。第65页，讲稿共110张，创作于星期三酶：酶：酶：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗体：抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞细胞：细胞：细胞：细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：核酸：核酸：核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合结合结合结合 蛋白蛋白
49、蛋白蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞具有专一性亲和力的生物分子对具有专一性亲和力的生物分子对第66页，讲稿共110张，创作于星期三Definitions in Affinity Chromatographyn nMatrix Matrix(基质或载体基质或载体):an inert gel to which a ligand can be coup
50、led:an inert gel to which a ligand can be coupledn nLiganLigand(d(配基配基):a component which interacts specifically with the target:a component which interacts specifically with the targetn nCoupling(Coupling(偶联偶联):covalent attachment of the ligand to the matrix):covalent attachment of the ligand to th