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1、关于基因分离与克隆第一页，讲稿共九十九页哦第九章第九章目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆第一节目的基因的获得第二节获得目的基因方法的选择第三节目的基因重组体的构建第二页，讲稿共九十九页哦目的基因1.目的基因：特定功能的基因与相应载体重组后能在宿主细胞中表达的DNA。2.用途：1.研究基因全貌和内涵（结构、功能、调控）2.发现新基因和寻找异常基因3.研究生物种系进化的同源性4.重组表达，研制基因药物5.基因改造来改变物种6.基因治疗第三页，讲稿共九十九页哦第四页，讲稿共九十九页哦第一节目的基因的获得一、基因的化学合成法二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因三、建立基因组DNA文库四、构
2、建cDNA文库筛选目的基因五、其他方法第五页，讲稿共九十九页哦原核生物原核生物：基因组小，限制性核酸内切酶切成若干片段后，可以用带有标记的核酸探针进行杂交筛选，人或哺乳类动物细胞：人或哺乳类动物细胞：基因组庞大，采用DNA重组技术把某种生物细胞的所有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆培养和保存这种克隆群体，这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞（大肠杆菌）中的各种重组DNA分子的集合体叫做DNA文库,简称文库（Library）。第六页，讲稿共九十九页哦一、基因的化学合成法随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。前提条件：对基因的结构序
3、列清楚。分为：基因片段的全化学合成基因的化学-酶促合成第七页，讲稿共九十九页哦1.化学合成法的基本策略（1）全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种策略。小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 第八页，讲稿共九十九页哦补丁延长法：混合退火根据目的基因两条互补链的全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段以及20-30个碱基的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合第九页，讲稿共九十九页哦大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-
4、50个碱基的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合第十页，讲稿共九十九页哦上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。第十一页，讲稿共九十九页哦（2）探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知。此时需要从已知的氨基酸序列推测其DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或c
5、DNA法得到的基因文库，最终获得含有目的基因的重组子。由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针。探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间。探针内部不应出现可能的互补区域。第十二页，讲稿共九十九页哦某段连续的氨基酸序列所有可能的DNA序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T G G G T T C设计的简并探针序列TGTATGGACGAIATGAATGTATGGATGAIATGAATGCATGGACGAIATGAATGCA
6、TGGATGAIATGAA A G三个位点，八条引物三个位点，八条引物第十三页，讲稿共九十九页哦简并序列少，更适合做探针此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计。第十四页，讲稿共九十九页哦2.化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法。具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，准确率高，合成速度快；但合成的核苷酸链不宜太长
7、，通常小于60bp。DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的。第十五页，讲稿共九十九页哦化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂DMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基Me：甲基：甲基第十六页，讲稿共九十九页哦3.基因化学合成的优点基因化学合成的优点可以合成细菌偏爱的密码子可以合成细菌偏爱的密码子可以定向改变个别氨基酸可以定向改变个别氨基酸可以在两端加上需要的限制酶切点可以在两端加上需要的限制酶切点可以通过自动化仪器合成可以通过自动化仪器合成第十七页，讲稿共九十九页哦4.DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改
8、造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头如胰岛素基因、干扰素基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 第十八页，讲稿共九十九页哦二、PCR法克隆目的基因 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。1.PCR法定向扩增目的基因的基本原理定义：定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。第十九页，讲稿共九十九页哦PCR技术反应
9、周期包括三个步骤：技术反应周期包括三个步骤：高温变性：通过加热使得复制双螺旋通过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，变性分离为单链，作为模板。（作为模板。（91，1分钟）。分钟）。低温退火：（约（约50，1分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板在此低温条件下分别与单链模板DNA两端的互补区段互补结合。两端的互补区段互补结合。适温延伸：将反应混合物的温度上升到将反应混合物的温度上升到72，保温，保温1分钟。分钟。第二十页，讲稿共九十九页哦第二十一页，讲稿共九十九页哦31第二十二页，讲稿共九十九页哦 PCR原原理理图图 32第二十三页，
10、讲稿共九十九页哦3.特点：特点：反复循环便于获得大量的基因拷贝Taq酶作用下每一轮PCR循环会产生103104的错配率,所以多用于基因检测，如果用于基因重组表达，在此之前必须进行DNA序列分析。2.应用：应用：1）诊断带有异常外源基因（如病毒）变异基因（肿瘤、遗传病等）2）合成特异基因或目的基因3）合成特异探针第二十四页，讲稿共九十九页哦1.基因文库的基本概念（1）基因库与基因文库基因库（gene pool）特定生物体基因组上所有基因的集合（天然存在）。基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方
11、法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部编码蛋白质的结构基因）三、建立基因组DNA文库第二十五页，讲稿共九十九页哦第二十六页，讲稿共九十九页哦（2）基因文库构建的基本策略用鸟枪法构建基因组文库：材料来自染色体DNA。所谓基因组文库是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。用cDNA法构建cDNA文库：材料来自mRNA。在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库有组织细胞的界定，如肝组织cDN
12、A文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。第二十七页，讲稿共九十九页哦根据基因文库的功能不同把基因文库分为：克隆文库：克隆载体 表达文库：表达载体（融合蛋白和天然蛋白表达载体），蛋白质表达文库（3）基因文库的类别第二十八页，讲稿共九十九页哦根据载体的不同把基因文库分为：质粒文库 噬菌体文库 柯斯质粒文库 人工染色体文库不同的载体适于构建不同的文库！第二十九页，讲稿共九十九页哦（4）基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率。它与基因文库所含最低克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1P)/ln(1f)其中：P=任一基因被克
13、隆（或存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。第三十页，讲稿共九十九页哦若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5105左右
14、,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体(YAC)922kb3045kb1001000kb105106转化子gDNA104106转化子gDNA500转化子gDNA表表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较三种常用基因组文库克隆载体的比较第三十一页，讲稿共九十九页哦（5）基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大：以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度：避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域：以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛
15、选第三十二页，讲稿共九十九页哦（1）基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3-5倍），经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得长达1000 kb的DNA片段。2.基因组文库的构建程序第三十三页，讲稿共九十九页哦（2）基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切
16、割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一超声波处理：DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法：一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！第三十四页，讲稿共九十九页哦（3）载体和受体的选择基因组文库构建的载体：出于压缩重组克隆数量的原因，通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。cDNA文库构
17、建的载体：通常选质粒，因为由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb。l-DNA上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒10 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb基因文库构建的受体：根据载体使用选择大肠杆菌或酵母菌。第三十五页，讲稿共九十九页哦在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！连接来寻找最佳比例！方法一：粘末端连接方法一：粘末端连接方法二：人工接头法方法二：人工接头法（4）载体与DNA片段的连接（5）转化或侵染宿主细胞在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的进口感受态细胞
18、和质量稳定的进口包装蛋白！第三十六页，讲稿共九十九页哦第三十七页，讲稿共九十九页哦（6）从基因组文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。第三十八页，讲稿共九十九页哦密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆第三十九页，讲稿共九十九页哦(7).利用改进的鸟枪法操作克隆目的基因使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色
19、体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高目的重组子的出现频率。（a）使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 第四十页，讲稿共九十九页哦例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。（b）在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0kb1.6kb1.8kb第四十一页，讲稿共九十九页哦冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法（c）凝胶DNA片段回收技术 第四十二页，讲稿共九十九页哦(8).鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较
20、大，需要了解目的基因的背景知识较难获得长度较小的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子序列优点：操作简单，命中率较高。优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会错漏目的基因。可能会错漏目的基因。第四十三页，讲稿共九十九页哦（9）基因组文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚
21、尾末端 第四十四页，讲稿共九十九页哦（10）构建基因组文库应注意的问题）构建基因组文库应注意的问题1、插入、插入DNA的质量的质量：构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯，以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。2、载体、载体DNA的质量的质量：不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针序列或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。3、DNA的消化的消化：部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6
22、个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。第四十五页，讲稿共九十九页哦4、连接、连接-在考虑把噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pg噬菌臂和4gDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于11066l06。5、包装抽提物的包装效率、包装抽提物的包装效率：贮存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存
23、几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。第四十六页，讲稿共九十九页哦基因组文库构建程序基因组文库构建程序随机酶切成较大的DNA片段（10-30Kb，平均20Kb)，对这些片段进行分离重组入适当载体（噬菌体）转化进宿主菌（E.coli)，扩增，构建成基因文库从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。（11）总结第四十七页，讲稿共九十九页哦 是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。cDNA的克隆对于特定
24、基因的分离和特性研究是极有价值的工具。cDNA文库最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。四、构建cDNA文库第四十八页，讲稿共九十九页哦特点：1.cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。2.mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。3.mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）4.可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白 5.不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同6.不能研究基因组的结构功能第四十九页，讲稿共九十九页哦mRNA（1）cDNA第一链的合成 5ppp5GGAAAAAAAAAAAAA
25、AOH 35ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本策略第五十页，讲稿共九十九页哦反转录酶：反转录酶：AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）（来自禽成髓细胞瘤病毒）MMLV（来自（来自Moloey鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）引物：引物：Oligo（dT）和随机引物）和随机引物Oligo（dT）引导的引导的cDNA合成合成是指是指Oligo（dT）引物与引物与mRNA3末端的末端的poly（A）配对，引导配对
26、，引导反转录酶以反转录酶以mRNA为模板合成第一链为模板合成第一链cDNA。这种这种cDNA合成的方法合成的方法在在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于cDNA末端存在较末端存在较长的长的poly（A）而影响而影响cDNA测序。测序。随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成合成采用采用610个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的从多个位点同时发
27、生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的分子的5端序列。端序列。随机引物随机引物cDNA合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于文库，一般用于克隆特定克隆特定mRNA的的5末端，如末端，如RT-PCR和和5-RACE。第五十一页，讲稿共九十九页哦（2）cDNA第二链的合成 煮沸NaOH自身引导法：AAAAAAAAAAAAAA5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1
28、 nuclease获得的双链cDNA的5端会有几对碱基缺失第五十二页，讲稿共九十九页哦DNApol dNTPsRNaesH置换合成法：5ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligaseRNaseH：催化：催化DNA-RNA杂合体的杂合体的RNA部分的核内降解，产生不同部分的核内降解，产生不同链长、带链长、带3羟基和羟基和5磷酸末端的寡
29、核糖核酸。磷酸末端的寡核糖核酸。获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失第五十三页，讲稿共九十九页哦dCTPTdT引导合成法：5ppp5GGAAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5GGAAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPs获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列第五十四页，讲稿共九十九页哦（3）双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下
30、列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。插入片段加装人工接头引入酶切位点，以便插入片段的回收。平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收。第五十五页，讲稿共九十九页哦第五十六页，讲稿共九十九页哦（1）完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。2.c
31、DNA法分离目的基因的基本程序第五十七页，讲稿共九十九页哦从总从总RNARNA构建构建cDNAcDNA文库文库能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。第五十八页，讲稿共九十九页哦1)取材：mRNA约占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经
32、抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2)从总的RNA中分离mRNA将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 oligo(dT)纤维素中进行亲和层析 从提纯的从提纯的mRNAmRNA构建构建cDNAcDNA文库文库第五十九页，讲稿共九十九页哦第六十页，讲稿共九十九页哦（2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。第六十一页，讲稿共九十九页哦3.cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构。细菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在细胞中含
33、量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。仅限于克隆蛋白质编码基因。第六十二页，讲稿共九十九页哦 核酸杂交法:以特殊标记的寡核苷酸链为探针 将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）4.筛选目的基因第六十三页，讲稿共九十九页哦第六十四页，讲稿共九十九页哦免疫结合法噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含
34、有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。第六十五页，讲稿共九十九页哦 基因组文库 cDNA文库信息供体 DNA mRNA载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链 连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针基因组文库和cDNA文库的比较第六十六页，讲稿共九十九页哦组织组织可克隆之可克隆之DNA载体载体DNAcDNAmRNA部分酶解部分酶解DNADNA长度分级长度分
35、级双链双链cDNADNA与载体连接与载体连接引入宿主细胞引入宿主细胞鉴定文库的完备性鉴定文库的完备性扩增后供长扩增后供长期储存期储存筛选出所需筛选出所需要的克隆要的克隆第六十七页，讲稿共九十九页哦1.1.应用差别杂交法构建应用差别杂交法构建cDNAcDNA文库文库适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆；技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达；可以通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。四、获得目的基因的其他方法第六十八页，讲稿共九十九页哦差示筛选差示筛选（Differential
36、Screening）第六十九页，讲稿共九十九页哦构建差示文库筛选特殊基因。差示文库（differentiallibrary）又称扣除文库（subtractedlibrary）,是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。2.应用扣除杂交法构建cDNA文库第七十页，讲稿共九十九页哦不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA的集合；用过量的参照细胞mRNA或cDNA与目的细胞cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从上述目的
37、细胞的cDNA文库中筛选目的克隆；实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表达的cDNA克隆及其它一些低丰度mRNA的cDNA克隆。第七十一页，讲稿共九十九页哦扣除杂交扣除杂交（Subtractive Hybridization）第七十二页，讲稿共九十九页哦扣除杂交法基本程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。第七十三页，讲稿共九十九页哦多瘤病毒感染的FR3T
38、3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆扣除杂交 第七十四页，讲稿共九十九页哦 3.mRNA差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为DD-PCR法,其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。第七十五页，讲稿共九十九页哦第七十六页，讲稿共九十九页哦第二节获得目的基因方法的选择一、根据获得目的基因的研究目的选择方法二、根据目的基因本身特点选择方法三、根据实验室设备条件选择方法第七十七页，讲稿
39、共九十九页哦第三节目的基因重组体的构建一、质粒DNA的分离纯化二、分子克隆载体的选择三、目的基因与载体的连接第七十八页，讲稿共九十九页哦分子克隆载体的选择分子克隆载体的选择选择克隆载体的几个重要参数选择克隆载体的几个重要参数（1 1）实验对象）实验对象 （2 2）实验性质）实验性质（3 3）载体容量）载体容量（4 4）合适克隆位点）合适克隆位点（5 5）载体的稳定性）载体的稳定性（6 6）载体）载体DNADNA制备的难易制备的难易（7 7）外源基因表达产物产量、产物特点等）外源基因表达产物产量、产物特点等第七十九页，讲稿共九十九页哦实验对象实验对象（1 1）供体：遗传背景与）供体：遗传背景与D
40、NADNA特点等，其中包括染色体特点等，其中包括染色体DNADNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。产物特点以及遗传物质的传递方式等。（2 2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式如遗传物质的传递方式(包括人为的方法包括人为的方法)，DNADNA限限制修饰系统，制修饰系统，DNADNA重组基因特点，基因产物修饰系统，重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。即转录与翻译后修饰系统。第八十页，讲稿共九十九页哦实验对象实验对象如常用于基因工
41、程的宿主菌如常用于基因工程的宿主菌E.coliE.coli，菌株不同，基因型亦不同，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：不同载体要求不同菌株。如：E.coli E.coli DH5DH5、E.coliE.coli DH5 DH5、E.coliE.coliDH5F DH5F 1 1）三者均有限制三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源修饰系统和重组基因缺陷，外源DNADNA可存活，可存活，且不发生重组且不发生重组2 2）DH5DH5和和 DH5FDH5F都具有一个可供遗传标记都具有一个可供遗传标记lacZlacZ检测的遗检测的遗传背景传背景3 3）DH5FDH5F可供可供M13m
42、pM13mp系列载体配套使用，系列载体配套使用，M13M13病毒的感染病毒的感染需要需要 FF的存在的存在第八十一页，讲稿共九十九页哦二、目的基因与载体的连接粘性末端的连接粘性末端的连接1.单酶切点的粘性末端全同源性粘性末端高背景双向插入,不能定向2.双酶切片段的定向克隆粘粘非同源互补的粘性末端重组方案中最有效简捷的途径。粘平第八十二页，讲稿共九十九页哦第八十三页，讲稿共九十九页哦第八十四页，讲稿共九十九页哦平端连接法平端连接法(除酶促外的平端链接方法除酶促外的平端链接方法)1.同聚物加尾法2.用衔接物连接法3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）EcoRI粘性末端：5AGCGGCCGCG
43、3TCGCCGGCGCTTAA5BamHIPasI粘性末端：5GATCCGG.CACTGCA33GCC.GTG5BamHIPasI4.TA克隆法TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3端加上两个游离的“A”。第八十五页，讲稿共九十九页哦第八十六页，讲稿共九十九页哦第八十七页，讲稿共九十九页哦第八十八页，讲稿共九十九页哦由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，用于PCR产物的克隆和测序。原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的线性载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到
44、位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。操作最简单，快速和高效，是Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法4.T载体第八十九页，讲稿共九十九页哦 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33末端末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基A A。克隆时。克隆时可以采取可以采取TdTTdT末端加末端加同聚尾同聚尾的方法与载体拼接，也可的方法与载体拼接，也可以使用专门的以使用专门的T T载体载体克隆克隆 PCR克隆目的基因的基本程序TT5555AAPCR扩增产物扩增产物T载体载体T7lacZMCSori
45、Apr第九十页，讲稿共九十九页哦TATA克隆的优点克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物不需使用含限制酶序列的引物不需把不需把PCRPCR产物做平端处理产物做平端处理不需在不需在PCRPCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。第九十一页，讲稿共九十九页哦注意事项注意事项 1.1.要获得目的基因的要获得目的基因的TATA克隆，克隆，PCRPCR产物产物的特异性要好。的特异性要好。2.PCR2.PCR产物在产物在TATA克隆前要通过纯化。克隆前要通过纯化。3.3.在在PCRPCR产物回收、纯化过程中防止外产物回收、纯化过程中防止外来来DNADNA污染。污染。第九十
46、二页，讲稿共九十九页哦pMD18-TpMD18-T图谱图谱第九十三页，讲稿共九十九页哦pSK-TpSK-T载体图谱载体图谱pSK-T vectorpSK-T vector两侧的两侧的33端，具有端，具有突出的碱基突出的碱基T T，可以和，可以和PCRPCR产物产物33末末端的端的A A碱基互补，从而大大提高碱基互补，从而大大提高PCRPCR产物的连接、克隆效率。可通过产物的连接、克隆效率。可通过互补的颜色反应来筛选重组子互补的颜色反应来筛选重组子3 33 3第九十四页，讲稿共九十九页哦pUC18-TpUC18-T克隆载体图谱克隆载体图谱第九十五页，讲稿共九十九页哦pUCm-TpUCm-T克隆载
47、体图谱克隆载体图谱第九十六页，讲稿共九十九页哦第九十七页，讲稿共九十九页哦1 1当一当一DNADNA片段插入终止子探针型载体片段插入终止子探针型载体pBU10pBU10的的HinHindd克隆位点后，克隆位点后，重组质粒仍可转化重组质粒仍可转化E.coli E.coli(CmlsTcs)(CmlsTcs)为为CmlrTcr CmlrTcr，为什么，为什么?可设计可设计什么实验证明其假设什么实验证明其假设?2 2当一当一DNADNA片段插入片段插入pUC18pUC18后，在后，在x-galx-gal平板上出现两类菌落，平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，
48、兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体均比原载体DNADNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNADNA却有两类，却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果相同。如何解释这一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是可设计何种实验证明你的解释是正确的正确的?3 3当把一外源当把一外源DNADNA插入一克隆载体后，重组插入一克隆载体后，重组DNADNA分子转化分子转化E.coliE.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组转化子中所含的重组DNADNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组化细胞中分离到的重组DNADNA分子可用限制酶回收插入的片段。而分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的从这两类转化细胞培养液所分离到的DNADNA却却思考题第九十八页，讲稿共九十九页哦感感谢谢大大家家观观看看第九十九页，讲稿共九十九页哦