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1、基因定位与克隆基因定位与克隆第一页，讲稿共五十四页哦本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略第二页，讲稿共五十四页哦基基因因定定位位(gene mapping)：利利用用一一定定的的方方法法将将一一个个基基因因确确定定到到染染色色体体上的实际位置上。上的实际位置上。l l1911年年，Wilson将将红红绿绿色色盲盲基基因因定定位位到到X染色体染色体l l1968年年，Duffy血血型型基基因因定定位位于于1号号染染色色体体第三页，讲稿共五十四页哦基基因因克克隆隆(gene clon
2、ing)：用用一一定定的的方方法法把把不不同同位位点点上上的的基基因因分分离离出来。出来。基基因因定定位位(gene mapping)：利利用用一一定定的的方方法法将将一一个个基基因因确确定定到到染染色色体上的实际位置上。体上的实际位置上。第四页，讲稿共五十四页哦连连锁锁分分析析(linkage analysis)：利利用用被被定定位位的的基基因因与与在在同同一一染染色色体体上上另另一一遗遗传传座座位位相相连连锁锁的的特特点点，将将该该基基因因定定位位在在某某一一染染色色体或染色体某一区带上。体或染色体某一区带上。连锁分析连锁分析第五页，讲稿共五十四页哦连锁分析连锁分析第六页，讲稿共五十四页哦
3、连锁分析连锁分析第七页，讲稿共五十四页哦连锁分析连锁分析第八页，讲稿共五十四页哦连锁分析连锁分析第九页，讲稿共五十四页哦连锁分析连锁分析第十页，讲稿共五十四页哦重重组组值值(recombination fraction)：是是基基因因定定位位时时两两个个基基因因间间遗遗传传图图距距的的量量度度，即即基因间的遗传距离。基因间的遗传距离。l l厘摩厘摩(centimorgan，cM)连锁分析连锁分析第十一页，讲稿共五十四页哦遗传标记遗传标记用用连连锁锁分分析析法法进进行行基基因因定定位位时时需需要要的的一一些些已已知知遗遗传传位位点点，这这些些位位点点应应按按孟孟德德尔尔方方式式遗遗传传，且且具具
4、有有多多态态性性以以便便显显示示连连锁锁关关系系，这这些些标标记记位位点点称称为为遗遗传传标标记记（genetic marker）。第十二页，讲稿共五十四页哦v v血型，血清蛋白，血型，血清蛋白，HLAv vDNA RFLPv vDNA STR&DNA VNTRv vSNP遗传标记遗传标记第十三页，讲稿共五十四页哦v v重组值重组值 0：10个减数分裂个减数分裂v v重组值重组值0.3：85个减数分裂个减数分裂遗传标记遗传标记第十四页，讲稿共五十四页哦连锁分析连锁分析第十五页，讲稿共五十四页哦EcoEcoR REcoEcoR REcoEcoR R3.0 kb3.0 kb1.7 kb1.7 kb
5、探针探针探针探针Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8连锁分析连锁分析第十六页，讲稿共五十四页哦Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 83.0 kb1.7 kb4.7 kb连锁分析连锁分析第十七页，讲稿共五十四页哦4.7 kb3.0 kbNeurof
6、ibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8连锁分析连锁分析第十八页，讲稿共五十四页哦Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb连锁分析连锁分析第十九页，讲稿共五十四页哦v v1955，Morton:优势对数法优势对数法(Lod)OO+3表示连锁
7、存在表示连锁存在OO-2表示连锁不存在表示连锁不存在连锁分析连锁分析第二十页，讲稿共五十四页哦l多点连锁定位多点连锁定位利利用用三三点点杂杂交交法法(three point crosses)，可可将将某某一一致致病病基基因因定定位位于于遗遗传传标标记记的的框框架架内内，更精确的进行基因定位。更精确的进行基因定位。连锁分析连锁分析第二十一页，讲稿共五十四页哦子代类型重组位置数 目ABC/abc非重组体853abc/abcABc/abc(A，B)-C5abC/abcaBC/abcA (B，C)47Abc/abcAbC/abcB (A，C)95aBc/abc多点连锁定位多点连锁定位第二十二页，讲稿共
8、五十四页哦体体细细胞胞杂杂交交(somatic(somatic cell cell hybridization)hybridization)又又又又称称称称细细胞胞融融合合(cell fusion)，是是将将两两个个同同种种和和/或或或或不不不不同同同同种种种种的的的的细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合成成成成一一一一个个个个新新新新细细细细胞胞胞胞，即即即即杂杂种种细细胞胞(hybrid cell)。l l病毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒l l化学融合技术化学融合技术化学融合技术化学融合技术聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(PEG)l l电融合技术电融合技术
9、电融合技术电融合技术电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法体细胞杂交体细胞杂交第二十三页，讲稿共五十四页哦体细胞杂交体细胞杂交第二十四页，讲稿共五十四页哦异核细胞异核细胞体细胞杂交体细胞杂交第二十五页，讲稿共五十四页哦体细胞杂交体细胞杂交合核细胞合核细胞杂种细胞杂种细胞第二十六页，讲稿共五十四页哦两两两两个个个个同同同同种种种种的的的的动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后形形形形成成成成的的的的杂杂杂杂种种种种细细细细胞胞胞胞，细细细细胞胞胞胞核核核核一一一一般般般般保保保保留留留留双双双双亲亲亲亲的的的的染染染染色色色色体体体体；不不不不同同同同种种种种动动动动物物物物的的的的
10、细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后，细细细细胞胞胞胞核核核核含含含含有有有有双双双双亲亲亲亲的的的的的的的的染染染染色色色色体体体体，但但但但随随随随着着着着增增增增殖殖殖殖传传传传代代代代的的的的过过过过程程程程，会会会会出出出出现现现现保保保保留留留留一一一一方方方方染染染染色色色色体体体体，另另另另一一一一方染色体逐渐丢失的现象。方染色体逐渐丢失的现象。方染色体逐渐丢失的现象。方染色体逐渐丢失的现象。体细胞杂交体细胞杂交第二十七页，讲稿共五十四页哦HAT选择系统选择系统v v1962，人类，人类HPRT-v v1964，小鼠，小鼠TK-OOH：次黄嘌呤：次黄嘌呤(hypoxanth
11、ine)OOA：氨基喋呤：氨基喋呤(Aminopterin)OOT：胸腺嘧啶：胸腺嘧啶(Thymidine)第二十八页，讲稿共五十四页哦HPRTHPRTTKTKHAT选择系统选择系统第二十九页，讲稿共五十四页哦TKTKHPRTHPRTHAT选择系统选择系统第三十页，讲稿共五十四页哦HAT选择系统选择系统第三十一页，讲稿共五十四页哦体细胞杂交体细胞杂交TK:chromosome 17第三十二页，讲稿共五十四页哦杂种细胞克隆嵌板杂种细胞克隆嵌板HybridcloneHuman chromosome12345678A+-B+-+-C+-+-+-+-第三十三页，讲稿共五十四页哦v v微细胞融合微细胞融
12、合(microcell fusion)体细胞杂交体细胞杂交人人工工建建立立的的仅仅含含有有一一条条人人类类染染色色体体的的杂杂种种细细胞胞，即即微微细细胞胞，再再与与啮啮齿齿类类细细胞胞进进行行融合。融合。第三十四页，讲稿共五十四页哦v v区域定位区域定位(regional assignment)体细胞杂交体细胞杂交依依据据染染色色体体结结构构畸畸变变的的特特点点，建建立立只只含含有有特特殊殊的的部部分分人人类类染染色色体体的的杂杂种种细细胞胞，再与啮齿类细胞进行融合。再与啮齿类细胞进行融合。第三十五页，讲稿共五十四页哦v v辐射杂种辐射杂种(radiation hybrid)体细胞杂交体细胞
13、杂交用用含含有有辐辐射射切切割割的的人人类类染染色色体体片片段段的的细细胞胞与与啮啮齿齿类类细细胞胞融融合合产产生生的的杂杂种种克克隆隆细细胞。胞。l l1975年，年，GossGoss和和和和Harris提出提出提出提出l l19901990年，年，Cox构建单染色体杂种细胞构建单染色体杂种细胞l l19941994年，年，年，年，WalterWalter建立全基因组放射杂种建立全基因组放射杂种第三十六页，讲稿共五十四页哦原原位位杂杂交交(In Site Hybridization，ISH)：利利用用同同位位素素标标记记的的DNA探探针针，与与玻玻片片上上的的中中期期染染色色体体进进行行杂杂
14、交交。是是一一种种直直接接进行基因定位的方法。进行基因定位的方法。原位杂交技术原位杂交技术第三十七页，讲稿共五十四页哦原位杂交技术原位杂交技术第三十八页，讲稿共五十四页哦荧荧光光原原位位杂杂交交(FISH)：用用用用特特特特殊殊殊殊的的的的荧荧荧荧光光光光素素素素标标标标记记记记DNA探探探探针针针针，与与与与玻玻玻玻片片片片上上上上的的的的染染染染色色色色体体体体或或或或细细细细胞胞胞胞组组组组织标本进行杂交。织标本进行杂交。织标本进行杂交。织标本进行杂交。原位杂交技术原位杂交技术第三十九页，讲稿共五十四页哦原位杂交技术原位杂交技术第四十页，讲稿共五十四页哦网络定位网络定位v vhttp:/
15、www.ncbi.nlm.nih.govv vhttp:/genome.ucsc.edu第四十一页，讲稿共五十四页哦基基因因克克隆隆(gene cloning)：用用一一定定的的方方法法把把不不同同位位点点上上的的基基因因分分离离出来。出来。基因克隆基因克隆第四十二页，讲稿共五十四页哦功功能能克克隆隆(functional cloning)是是先先研研究究相关基因的功能，再定位克隆该基因。相关基因的功能，再定位克隆该基因。l l血红蛋白病血红蛋白病HbS HbS 血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷(1949)链链 Glu6Val GAG GTG 11p(7011p(70年代年代)
16、功能克隆功能克隆第四十三页，讲稿共五十四页哦定位克隆定位克隆定定位位克克隆隆(positional cloning)是是将将遗遗传传病病或或发发育育异异常常畸畸形形与与相相关关表表型型之之间间，和和由由这这些些突突变变失失活活的的基基因因所所编编码码的的特特定定蛋蛋白白质质之之间间联联系系起来，而提供的一种基因定位克隆方法。起来，而提供的一种基因定位克隆方法。第四十四页，讲稿共五十四页哦定位克隆定位克隆v定位克隆的等级定位克隆的等级l l应应用用细细胞胞遗遗传传学学或或连连锁锁分分析析方方法法将将基基因因定定位位于染色体的特定区域于染色体的特定区域l l从从该该区区域域内内所所有有可可能能的的
17、候候选选基基因因中中确确定定正确的基因正确的基因第四十五页，讲稿共五十四页哦定位克隆定位克隆v v定位克隆的基本方法和步骤定位克隆的基本方法和步骤l l收收集集家家系系，选选择择遗遗传传标标记记进进行行连连锁锁分分析析，对目的基因作图定位对目的基因作图定位l l确确定定候候选选位位置置，对对目目的的基基因因进进行行精精细细定定位位l l从候选基因中确定正确的基因从候选基因中确定正确的基因第四十六页，讲稿共五十四页哦年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 19861986慢性肉芽肿瘤慢性肉芽肿瘤Duchenne Duchenne 肌营养不良肌营养不良视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 19931993M
18、enkesMenkes病病 X X连锁无丙种球蛋白血症连锁无丙种球蛋白血症 肾上腺白质营养不良肾上腺白质营养不良19891989囊性纤维变性囊性纤维变性 神经纤维瘤神经纤维瘤型型 19901990 WilmsWilms瘤瘤神经纤维瘤神经纤维瘤型型 睾丸决定因子睾丸决定因子(TDF)(TDF)无脉胳膜症无脉胳膜症 HuntingtonHuntington病病 Von Hippel-LindouVon Hippel-Lindou病病 脊髓小脑性共济失调脊髓小脑性共济失调型型 WilsonWilson病病 19911991脆性脆性X X综合征综合征 家族性结肠息肉症家族性结肠息肉症 Kallmann
19、Kallmann综合征综合征 无虹膜症无虹膜症 19941994结节硬化症结节硬化症 多囊肾病多囊肾病1 1型型 Wiscott-AldrichWiscott-Aldrich综合征综合征 早早 发发 性性 乳乳 腺腺 癌癌/卵卵 巢巢 癌癌(BRCA1)(BRCA1)19921992肌强直性肌营养不良肌强直性肌营养不良 LoweLowe综合征综合征 先天性肾上腺发育不良先天性肾上腺发育不良 用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因第四十七页，讲稿共五十四页哦用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 19951995点状软骨发育不全点状
20、软骨发育不全肢带肌营养不良肢带肌营养不良 眼白化病眼白化病 毛细血管扩张性共济失调毛细血管扩张性共济失调 AlzheimerAlzheimer病病(14(14号染色体号染色体)AlzheimerAlzheimer病病(1(1号染色体号染色体)低磷酸盐血性佝偻病低磷酸盐血性佝偻病 遗传性多发性外生骨疣遗传性多发性外生骨疣 BloomBloom综合征综合征 19961996FriedreichFriedreich共济失调共济失调 进行性肌阵挛癫痫进行性肌阵挛癫痫长长QTQT综合征综合征(11(11号染色体号染色体)WernerWerner综合征综合征X X连锁视网膜色素变性连锁视网膜色素变性(RP
21、3)(RP3)多囊肾病多囊肾病2 2型型基底细胞痣综合征基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常无汗型外胚层发育异常血色病血色病Chediak-HigashiChediak-Higashi综合征综合征青年的成年期发病型糖尿病青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12(MODY)(12号染色体号染色体)第四十八页，讲稿共五十四页哦A AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGC CA AA AC CC CGGA AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGT TA AA AC CC CGGMetMetValValSerSerLeuLeuGlnGlnProProM
22、etMetValValSerSerLeuLeuStop定位克隆定位克隆第四十九页，讲稿共五十四页哦候选克隆候选克隆候候选选克克隆隆(candidate cloning)是是一一种种用用定定位位和和非非定定位位的的信信息息相相结结合合来来克克隆隆致致病病基基因因，即即根根据据一一些些基基因因的的位位置置、表表达达、功功能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。第五十页，讲稿共五十四页哦v定位候选克隆定位候选克隆GDB或或GenBank已知的基因或已知的基因或EST与疾病关系与疾病关系确定致病基因确定致病基因候选克隆候选克隆第五十一页，讲稿共五十四页哦候选克隆候选克隆
23、v功能候选克隆功能候选克隆GDB或或GenBank已知基因已知基因已定位的疾病已定位的疾病与该基因关系与该基因关系确定致病基因确定致病基因第五十二页，讲稿共五十四页哦本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略第五十三页，讲稿共五十四页哦本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略第五十四页，讲稿共五十四页哦