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1、基因定位与克隆基因定位与克隆现在学习的是第1页，共54页本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略现在学习的是第2页，共54页基基因因定定位位(gene mapping)：利利用用一一定定的的方方法法将将一一个个基基因因确确定定到到染染色色体上的实际位置上。体上的实际位置上。l l1911年年，Wilson将将将将红红红红绿绿绿绿色色色色盲盲盲盲基基基基因因因因定定定定位位位位到到到到X X染色体染色体染色体染色体l l1968年年，DuffyDuffy血血型型基基因因定定位位于于1
2、1号号号号染染染染色色色色体体体体现在学习的是第3页，共54页基基因因克克隆隆(gene cloning)：用用一一定定的的方方法法把不同位点上的基因分离出来。把不同位点上的基因分离出来。基基因因定定位位(gene mapping)：利利用用一一定定的的方方法法将将一一个个基基因因确确定定到到染染色色体体上的实际位置上。上的实际位置上。现在学习的是第4页，共54页连连连连锁锁锁锁分分分分析析析析(linkage analysis)：利利利利用用用用被被被被定定定定位位位位的的的的基基基基因因因因与与与与在在在在同同同同一一一一染染染染色色色色体体体体上上上上另另另另一一一一遗遗遗遗传传传传座座
3、座座位位位位相相相相连连连连锁锁锁锁的的的的特特特特点点点点，将将将将该该该该基基基基因因因因定定定定位位位位在在在在某某某某一一一一染染染染色色色色体体体体或或或或染色体某一区带上。染色体某一区带上。染色体某一区带上。染色体某一区带上。连锁分析连锁分析现在学习的是第5页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第6页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第7页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第8页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第9页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第10页，共54页重重组组值值(recombination fraction)：是是基基因因定定位位时时两两个个基
4、基因因间间遗遗传传图图距距的的量量度度，即即基基因间的遗传距离。因间的遗传距离。l l厘摩厘摩(centimorgan，cM)连锁分析连锁分析现在学习的是第11页，共54页遗传标记遗传标记用用连连锁锁分分析析法法进进行行基基因因定定位位时时需需要要的的一一些些已已知知遗遗传传位位点点，这这些些位位点点应应按按孟孟德德尔尔方方式式遗遗传传，且且具具有有多多态态性性以以便便显显示示连连锁锁关关系系，这这 些些 标标 记记 位位 点点 称称 为为 遗遗 传传 标标 记记（genetic marker）。现在学习的是第12页，共54页v v血型，血清蛋白，血型，血清蛋白，HLAv vDNA RFLPv
5、 vDNA STR&DNA VNTRv vSNP遗传标记遗传标记现在学习的是第13页，共54页v v重组值重组值 0：10个减数分裂个减数分裂v v重组值重组值0.3：85个减数分裂个减数分裂遗传标记遗传标记现在学习的是第14页，共54页连锁分析连锁分析现在学习的是第15页，共54页EcoEcoR REcoEcoR REcoEcoR R3.0 kb3.0 kb1.7 kb1.7 kb探针探针探针探针Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4
6、 5 6 7 8连锁分析连锁分析现在学习的是第16页，共54页Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 83.0 kb1.7 kb4.7 kb连锁分析连锁分析现在学习的是第17页，共54页4.7 kb3.0 kbNeurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8连锁
7、分析连锁分析现在学习的是第18页，共54页Neurofibroma,NFNeurofibroma,NF1 1RFLPRFLP1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb连锁分析连锁分析现在学习的是第19页，共54页v v1955，Morton:优势对数法优势对数法(Lod)OO+3表示连锁存在表示连锁存在OO-2-2表示连锁不存在表示连锁不存在连锁分析连锁分析现在学习的是第20页，共54页l l多点连锁定位多点连锁定位利利用用三三点点杂杂交交法法(three point crosse
8、s)，可可将将某某一一致致病病基基因因定定位位于于遗遗传传标标记记的的框框架架内内，更精确的进行基因定位。更精确的进行基因定位。连锁分析连锁分析现在学习的是第21页，共54页子代类型子代类型重组位置重组位置数数 目目ABC/abcABC/abc非重组体非重组体853853abc/abcabc/abcABc/abcABc/abc(A(A，B)B)-C-C5 5abC/abcabC/abcaBC/abcaBC/abcA A (B (B，C)C)4747Abc/abcAbc/abcAbC/abcAbC/abcB B (A (A，C)C)9595aBc/abcaBc/abc多点连锁定位多点连锁定位现在
9、学习的是第22页，共54页体体体体细细细细胞胞胞胞杂杂杂杂交交交交(somatic(somatic cell cell hybridization)hybridization)又又又又称称称称细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合(cell(cell fusion)fusion)，是是是是将将将将两两两两个个个个同同同同种种种种和和和和/或或或或不不不不同同同同种种种种的的的的细胞融合成一个新细胞，即细胞融合成一个新细胞，即细胞融合成一个新细胞，即细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞杂种细胞杂种细胞杂种细胞(hybrid cell)(hybrid cell)。l l病毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合病
10、毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒l l化学融合技术化学融合技术化学融合技术化学融合技术聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)l l电融合技术电融合技术电融合技术电融合技术电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法体细胞杂交体细胞杂交现在学习的是第23页，共54页体细胞杂交体细胞杂交现在学习的是第24页，共54页异核细胞异核细胞体细胞杂交体细胞杂交现在学习的是第25页，共54页体细胞杂交体细胞杂交合核细胞合核细胞杂种细胞杂种细胞现在学习的是第26页，共54页两两两两个个个个同同同同种种种种的的的的动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后形形形
11、形成成成成的的的的杂杂杂杂种种种种细细细细胞胞胞胞，细细细细胞胞胞胞核核核核一一一一般般般般保保保保留留留留双双双双亲亲亲亲的的的的染染染染色色色色体体体体；不不不不同同同同种种种种动动动动物物物物的的的的细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后，细细细细胞胞胞胞核核核核含含含含有有有有双双双双亲亲亲亲的的的的的的的的染染染染色色色色体体体体，但但但但随随随随着着着着增增增增殖殖殖殖传传传传代代代代的的的的过过过过程程程程，会会会会出出出出现现现现保保保保留留留留一一一一方方方方染染染染色色色色体体体体，另另另另一一一一方方方方染染染染色色色色体逐渐丢失的现象。体逐渐丢失的现象。体逐渐丢失的现
12、象。体逐渐丢失的现象。体细胞杂交体细胞杂交现在学习的是第27页，共54页HAT选择系统选择系统v v1962，人类，人类HPRT-v v1964，小鼠，小鼠TK-OOHH：次黄嘌呤：次黄嘌呤：次黄嘌呤：次黄嘌呤(hypoxanthine)(hypoxanthine)OOA：氨基喋呤：氨基喋呤(Aminopterin)OOT T：胸腺嘧啶：胸腺嘧啶：胸腺嘧啶：胸腺嘧啶(Thymidine)(Thymidine)现在学习的是第28页，共54页HPRTHPRTTKTKHAT选择系统选择系统现在学习的是第29页，共54页TKTKHPRTHPRTHAT选择系统选择系统现在学习的是第30页，共54页HAT
13、选择系统选择系统现在学习的是第31页，共54页体细胞杂交体细胞杂交TK:chromosome 17现在学习的是第32页，共54页杂种细胞克隆嵌板杂种细胞克隆嵌板HybridcloneHuman chromosome12345678A+-B+-+-C+-+-+-+-现在学习的是第33页，共54页v v微细胞融合微细胞融合(microcell fusion)体细胞杂交体细胞杂交人人人人工工工工建建建建立立立立的的的的仅仅仅仅含含含含有有有有一一一一条条条条人人人人类类类类染染染染色色色色体体体体的的的的杂杂杂杂种种种种细细细细胞胞胞胞，即即即即微微细细胞胞，再再再再与与与与啮啮啮啮齿齿齿齿类类类类
14、细细细细胞胞胞胞进进进进行行行行融融融融合。合。合。合。现在学习的是第34页，共54页v v区域定位区域定位(regional assignment)体细胞杂交体细胞杂交依依据据染染色色体体结结构构畸畸变变的的特特点点，建建立立只只含含有有特特殊殊的的部部分分人人类类染染色色体体的的杂杂种种细细胞胞，再与啮齿类细胞进行融合。再与啮齿类细胞进行融合。现在学习的是第35页，共54页v v辐射杂种辐射杂种(radiation hybrid)体细胞杂交体细胞杂交用用用用含含含含有有有有辐辐辐辐射射射射切切切切割割割割的的的的人人人人类类类类染染染染色色色色体体体体片片片片段段段段的的的的细细细细胞胞胞
15、胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。l l19751975年，年，年，年，GossGoss和和和和HarrisHarris提出提出提出提出l l19901990年，年，年，年，CoxCox构建单染色体杂种细胞构建单染色体杂种细胞构建单染色体杂种细胞构建单染色体杂种细胞l l19941994年，年，年，年，WalterWalter建立全基因组放射杂种建立全基因组放射杂种建立全基因组放射杂种建立全基因组放射杂种现在学习的是第36页，共54页原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交(In(In Si
16、te Site HybridizationHybridization，ISH)ISH)：利利用用同同位位素素标标记记的的DNADNA探探针针，与与玻玻片片上上的的中中期期染染色色体体进进行行杂杂交交。是是一一种种直直接接进行基因定位的方法。进行基因定位的方法。原位杂交技术原位杂交技术现在学习的是第37页，共54页原位杂交技术原位杂交技术现在学习的是第38页，共54页荧荧荧荧光光光光原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交(FISH)FISH)：用用用用特特特特殊殊殊殊的的的的荧荧荧荧光光光光素素素素标标标标记记记记DNADNA探探探探针针针针，与与与与玻玻玻玻片片片片上上上上的的的的染染染染色色色色体
17、体体体或或或或细细细细胞胞胞胞组组组组织织织织标本进行杂交。标本进行杂交。标本进行杂交。标本进行杂交。原位杂交技术原位杂交技术现在学习的是第39页，共54页原位杂交技术原位杂交技术现在学习的是第40页，共54页网络定位网络定位v vhttp:/www.ncbi.nlm.nih.govv vhttp:/genome.ucsc.edu现在学习的是第41页，共54页基基因因克克隆隆(gene cloning)：用用一一定定的的方方法法把不同位点上的基因分离出来。把不同位点上的基因分离出来。基因克隆基因克隆现在学习的是第42页，共54页功功能能克克隆隆(functional cloning)是是先先研
18、研究究相关基因的功能，再定位克隆该基因。相关基因的功能，再定位克隆该基因。l l血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病HbS HbS 血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷血红蛋白缺陷(1949)(1949)链链链链 Glu6Val GAG GTGGlu6Val GAG GTG 11p(7011p(70年代年代年代年代)功能克隆功能克隆现在学习的是第43页，共54页定位克隆定位克隆定定位位克克隆隆(positional cloning)是是将将将将遗遗遗遗传传传传病病病病或或或或发发发发育育育育异异异异常常常常畸畸畸畸形形形形与与与与相相相相关关关关表表表表型型型型之之之之间间间间，和和和和由
19、由由由这这这这些些些些突突突突变变变变失失失失活活活活的的的的基基基基因因因因所所所所编编编编码码码码的的的的特特特特定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质之之之之间间间间联联联联系系系系起起起起来来来来，而提供的一种基因定位克隆方法。而提供的一种基因定位克隆方法。而提供的一种基因定位克隆方法。而提供的一种基因定位克隆方法。现在学习的是第44页，共54页定位克隆定位克隆v v定位克隆的等级定位克隆的等级l l应应应应用用用用细细细细胞胞胞胞遗遗遗遗传传传传学学学学或或或或连连连连锁锁锁锁分分分分析析析析方方方方法法法法将将将将基基基基因因因因定定定定位于染色体的特定区域位于染色体的特定区域位于染色体
20、的特定区域位于染色体的特定区域l l从从该该区区域域内内所所有有可可能能的的候候选选基基因因中中确确定定正确的基因正确的基因现在学习的是第45页，共54页定位克隆定位克隆v v定位克隆的基本方法和步骤定位克隆的基本方法和步骤l l收收收收集集集集家家家家系系系系，选选选选择择择择遗遗遗遗传传传传标标标标记记记记进进进进行行行行连连连连锁锁锁锁分分分分析析析析，对对对对目的基因作图定位目的基因作图定位目的基因作图定位目的基因作图定位l l确定候选位置，对目的基因进行精细定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位l l从候选基因
21、中确定正确的基因从候选基因中确定正确的基因从候选基因中确定正确的基因从候选基因中确定正确的基因现在学习的是第46页，共54页年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 19861986慢性肉芽肿瘤慢性肉芽肿瘤Duchenne Duchenne 肌营养不良肌营养不良视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 19931993MenkesMenkes病病 X X连锁无丙种球蛋白血症连锁无丙种球蛋白血症 肾上腺白质营养不良肾上腺白质营养不良19891989囊性纤维变性囊性纤维变性 神经纤维瘤神经纤维瘤型型 19901990 WilmsWilms瘤瘤神经纤维瘤神经纤维瘤型型 睾丸决定因子睾丸决定因子(TDF)(TDF)无
22、脉胳膜症无脉胳膜症 HuntingtonHuntington病病 Von Hippel-LindouVon Hippel-Lindou病病 脊髓小脑性共济失调脊髓小脑性共济失调型型 WilsonWilson病病 19911991脆性脆性X X综合征综合征 家族性结肠息肉症家族性结肠息肉症 KallmannKallmann综合征综合征 无虹膜症无虹膜症 19941994结节硬化症结节硬化症 多囊肾病多囊肾病1 1型型 Wiscott-AldrichWiscott-Aldrich综合征综合征 早早 发发 性性 乳乳 腺腺 癌癌/卵卵 巢巢 癌癌(BRCA1)(BRCA1)19921992肌强直性肌
23、营养不良肌强直性肌营养不良 LoweLowe综合征综合征 先天性肾上腺发育不良先天性肾上腺发育不良 用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因现在学习的是第47页，共54页用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 19951995点状软骨发育不全点状软骨发育不全肢带肌营养不良肢带肌营养不良 眼白化病眼白化病 毛细血管扩张性共济失调毛细血管扩张性共济失调 AlzheimerAlzheimer病病(14(14号染色体号染色体)AlzheimerAlzheimer病病(1(1号染色体号染色体)低磷酸盐血性佝偻病低磷酸盐血性佝偻病 遗传性多发性
24、外生骨疣遗传性多发性外生骨疣 BloomBloom综合征综合征 19961996FriedreichFriedreich共济失调共济失调 进行性肌阵挛癫痫进行性肌阵挛癫痫长长QTQT综合征综合征(11(11号染色体号染色体)WernerWerner综合征综合征X X连锁视网膜色素变性连锁视网膜色素变性(RP3)(RP3)多囊肾病多囊肾病2 2型型基底细胞痣综合征基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常无汗型外胚层发育异常血色病血色病Chediak-HigashiChediak-Higashi综合征综合征青年的成年期发病型糖尿病青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12(MODY)(12号染色体号染
25、色体)现在学习的是第48页，共54页A AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGC CA AA AC CC CGGA AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGT TA AA AC CC CGGMetMetValValSerSerLeuLeuGlnGlnProProMetMetValValSerSerLeuLeuStop定位克隆定位克隆现在学习的是第49页，共54页候选克隆候选克隆候候候候选选选选克克克克隆隆隆隆(candidate cloning)是是一一一一种种种种用用用用定定定定位位位位和和和和非非非非定定定定位位位位的的的的信信信信息息息息相相
26、相相结结结结合合合合来来来来克克克克隆隆隆隆致致致致病病病病基基基基因因因因，即即即即根根根根据据据据一一一一些些些些基基基基因因因因的的的的位位位位置置置置、表表表表达达达达、功功功功能能能能或或或或同同同同源源源源性性性性相相相相结结结结合鉴定候选基因的方法。合鉴定候选基因的方法。合鉴定候选基因的方法。合鉴定候选基因的方法。现在学习的是第50页，共54页v定位候选克隆定位候选克隆GDB或或GenBank已知的基因或已知的基因或EST与疾病关系与疾病关系确定致病基因确定致病基因候选克隆候选克隆现在学习的是第51页，共54页候选克隆候选克隆v功能候选克隆功能候选克隆GDB或或GenBank已知
27、基因已知基因已定位的疾病已定位的疾病与该基因关系与该基因关系确定致病基因确定致病基因现在学习的是第52页，共54页本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略现在学习的是第53页，共54页本章节重点本章节重点l l基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念基因定位和基因克隆的概念l l连锁分析连锁分析连锁分析连锁分析l l遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记l l基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略基因克隆的策略现在学习的是第54页，共54页