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1、植物原生质体培养第1页，共29页，编辑于2022年，星期六一、两个概念n再生植株再生植株n工程植株工程植株第2页，共29页，编辑于2022年，星期六第3页，共29页，编辑于2022年，星期六二、原生质体分离 1 1 材料来源材料来源 植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。壁。植株的年龄和生长条件是十分重要的。植株的年龄和生长条件是十分重
2、要的。第4页，共29页，编辑于2022年，星期六来源：来源：无菌苗无菌苗 温室培养的苗温室培养的苗培养条件：培养条件：低光照强度（低光照强度（1000lx1000lx）短日照短日照 温度为温度为202025 25 相对湿度为相对湿度为60%60%80%80%以及充足的氮肥供应。以及充足的氮肥供应。第5页，共29页，编辑于2022年，星期六 2 2 前处理前处理 要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。为此，要做到：到叶片细胞间隙中。为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片
3、漂浮在酶液中。漂浮在酶液中。或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。或用金刚砂摩擦叶的下表皮。或用金刚砂摩擦叶的下表皮。第6页，共29页，编辑于2022年，星期六3 提取方法机械分离法（机械分离法（Machanical isolationMachanical isolation）酶法分离（酶法分离（Enzymatic isolationEnzymatic isolation）第7页，共29页，编辑于2022年，星期六 早在早在18921892年，克莱若克（年，克莱若克（KlerckerKlercker）就已采用机械法分离）就已采用机械法分离原生质体。原生
4、质体。方法方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。完整的原生质体。缺点缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织和其：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。机械法机械法第8页，共29页，编辑于2022年，星期六第9页，共29页，编辑于2022年，星期六酶解法酶解法 19601960年年Norkingh
5、anNorkinghan大学的植物生理学家大学的植物生理学家CookingCooking用酶法降解细胞壁，获番茄根尖原生质用酶法降解细胞壁，获番茄根尖原生质体，开创了大量获得原生质体的的方法。体，开创了大量获得原生质体的的方法。2020世纪九十年代以来，国内外原生质体培养世纪九十年代以来，国内外原生质体培养取得了突飞猛进的发展。取得了突飞猛进的发展。19711971年，年，TakebeTakebe等人在等人在烟草上首次由原生质体培养获得植株。至今已获得酶烟草上首次由原生质体培养获得植株。至今已获得酶法制备植物原生质体操作方法。法制备植物原生质体操作方法。第10页，共29页，编辑于2022年，星
6、期六材料准备材料准备：植物的幼嫩部分：植物的幼嫩部分幼叶、根、下胚轴，幼叶、根、下胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。材料预处理材料预处理：叶片萎焉处理叶片萎焉处理日光下日光下2 28 8小时小时 叶片预培养叶片预培养如羽衣甘蓝诱导愈伤组织培养基如羽衣甘蓝诱导愈伤组织培养基 培养培养7 7天后天后 预先质壁分离预先质壁分离糖溶液中质壁分离糖溶液中质壁分离第11页，共29页，编辑于2022年，星期六 酶解酶解 纤维素酶类（纤维素酶类（CellulaseCellulase）果胶酶类（果胶酶类（PectolyasePectolyase）半纤维素酶类（半纤维素酶类（H
7、emicellulaseHemicellulase）崩溃酶崩溃酶蜗牛酶蜗牛酶第12页，共29页，编辑于2022年，星期六 原生质体分离常用的商品酶原生质体分离常用的商品酶 酶酶 来源来源 生产厂家生产厂家纤维素酶类纤维素酶类onozuka R10 绿色木霉绿色木霉 Yakult Honsha Co.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin 绿色木霉绿色木霉 Calbiochem.,San Diego,CA 92037,USADriselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co.,Tokyo,Japan果胶酶类果胶酶类Macerozyme R-10
8、 根霉根霉 Yakylt Honsha Co.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase 黑曲霉黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St.Louit,MO 63178,USAPectolyase Y-23 黑曲霉黑曲霉 Seishin Pharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶半纤维素酶Rhozyme HP-150 黑曲酶黑曲酶Rohm and Hass Co.,Philadelphia,PA 19105,USAHemicellulase 黑曲霉黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO 63178,USA 第13页，共29页，编辑
9、于2022年，星期六 纤维素酶纤维素酶从绿色木霉中提取。用于活力不从绿色木霉中提取。用于活力不同：同：P1500P1500、P5000P5000、OnozukaR-10 OnozukaR-10（常用）（常用）果胶酶（离析酶）果胶酶（离析酶）从根霉、黑曲霉中提取。浓从根霉、黑曲霉中提取。浓度若超过度若超过2 2，分离时间过长，均易产生毒害。常用，分离时间过长，均易产生毒害。常用(MacerozymeR-10)(MacerozymeR-10)。半纤维素酶从黑曲霉中提取。常用于从愈伤半纤维素酶从黑曲霉中提取。常用于从愈伤组织中分离原生质体；常用组织中分离原生质体；常用Rhozyme HP-150Rh
10、ozyme HP-150；蜗牛酶蜗牛酶分离孢粉素、胼胝质分离孢粉素、胼胝质。第14页，共29页，编辑于2022年，星期六步骤步骤：二步法：离析酶二步法：离析酶纤维素酶纤维素酶 一步法：复合酶处理一步法：复合酶处理优点优点：可获得大量的原生质体，几乎适用：可获得大量的原生质体，几乎适用于所有植物的器官、组织和细胞。于所有植物的器官、组织和细胞。缺点缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、酚类等物质，影响原生质体的活力。酚类等物质，影响原生质体的活力。第15页，共29页，编辑于2022年，星期六注意事项：注意事项：酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基
11、或特殊配制。酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围浓度范围450450800mmol/L800mmol/L 酶处理：酶处理：酶浓度酶浓度 酶解时间酶解时间 酶解温度酶解温度 第16页，共29页，编辑于2022年，星期六图示：原生质体分离过程（以叶片为例）图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶第17页，共29页，编辑于2022年，星期六三、原生质体的纯化 材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生
12、质体释放出来。叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。去。第18页，共29页，编辑于2022年，星期六三种方法三种方法离心沉淀法离心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法第19页，共29页，编辑于2022年，星期六离心沉淀法原理：原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。底部。步骤：步骤：第一步原生质体溶液用第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。目网筛过滤。第二步离心（第二
13、步离心（5001000rpm,离心离心56min）。）。第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如此此23次。次。第四步用原生质体培养液洗第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。次，收集原生质体。第20页，共29页，编辑于2022年，星期六漂浮法原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。碎屑沉到管底。离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液质体带出现在蔗糖溶液
14、和原生质体悬浮液培养基的界面上。培养基的界面上。第21页，共29页，编辑于2022年，星期六界面法界面法500mmol/L蔗糖蔗糖 140mmol/L蔗糖蔗糖+360mmol/L山梨醇山梨醇原理：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。液小于原生质体的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇山梨醇+原生质体原生质体第22页，共29页，编辑于2022年，星期六Protoplast culture and fertile green plant reg
15、eneration of rye.a Friable embryogenic calli,b suspension cell aggregates,c freshly isolated protoplasts from suspension culture,d protoplasts stained with FDA,e division of cell derived from protoplasts,f cell colonies derived from protoplast,g proto-calli developed from protoplasts embedded in aga
16、rose,h green shoot formation,i fertile green plant第23页，共29页，编辑于2022年，星期六a:first division,10 days after protoplast isolationb,c:2 and 3 wo microcolonies.d,e:4 and 6 wo microcallif:8 wo microcalli just before being transferred onto B5 mediumabcdef第24页，共29页，编辑于2022年，星期六ihgRecovery of plantlets through
17、somatic embryogenesisg:Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos.h:Transfer of globular embryos onto B5 medium for maturation of somatic embryos.i:Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.第25页，共29页，编辑于2022年，星期六四、原生质体培养
18、研究进展第26页，共29页，编辑于2022年，星期六膜片钳技术19761976年年11德国马普生物物理研究所德国马普生物物理研究所NeherNeher和和SakmannSakmann创建了膜片创建了膜片钳技术（钳技术（patch clamp recording techniquepatch clamp recording technique）。这是一种以）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene gene cloningclon
19、ing）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大的贡献，使这一伟大的贡献，使NeherNeher和和SakmannSakmann获得获得19911991年度的诺贝年度的诺贝尔生理学与医学奖。尔生理学与医学奖。第27页，共29页，编辑于2022年，星期六非对称细胞融合技术 所谓非对称细胞融合技术，即利用某种外界因素所谓非对称细胞融合技术，即利用某种外界因素(常为常为射线，即射线，即融合融合gamma-fusion)gamma-fusion)辐照某一细胞原生质体，选辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核；并用碘乙酰胺碱性蕊香红择性地
20、破坏其细胞核；并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G6G处理在处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活，然后融合来自这两个原性质体品系的细其细胞质失活，然后融合来自这两个原性质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时，改良其某个不良性保留亲本之一全部优良性状的同时，改良其某个不良性状。状。第28页，共29页，编辑于2022年，星期六第29页，共29页，编辑于2022年，星期六