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1、原生质体培养与融原生质体培养与融合合第1页，共75页，编辑于2022年，星期五原生质体原生质体(protoplast)：脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。v亚原生质体亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。可不具有细胞核。v核质体核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞
2、质包围细胞核形成的小原生质体。由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。也称为微小原生质体。v胞质体胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。第2页，共75页，编辑于2022年，星期五Protoplast system Organogenesis Regenerative abilityOntogenic processes Cell differentiation Somatic genetics Cell physiology Cell cloning Organelle,DNA uptake Cel
3、l fusion 应应 用用第3页，共75页，编辑于2022年，星期五v 植物细胞育种中的核质替换植物细胞育种中的核质替换v 细胞质杂种的获得细胞质杂种的获得v 远缘杂交创造新物种细胞远缘杂交创造新物种细胞v 细胞器的互作研究细胞器的互作研究意意 义义第4页，共75页，编辑于2022年，星期五植物原生质体的分离和培养植物原生质体的分离和培养v材料预处理材料预处理v原生质体分离的方法原生质体分离的方法v原生质体纯化原生质体纯化v原生质体活力测定原生质体活力测定v影响原生质体数量和活力的因素影响原生质体数量和活力的因素v原生质体培养方法原生质体培养方法v影响原生质体培养的因素影响原生质体培养的因素
4、v原生质体再生过程原生质体再生过程Flash第5页，共75页，编辑于2022年，星期五用于分离原生质体的材料用于分离原生质体的材料材料预处理材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。可提高某些材料原生质体的产量和活力。龙胆试管苗的叶片用龙胆试管苗的叶片用4 4o oC C处理较好。处理较好。甘蔗植株必须先在黑暗下培养甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h12h后分离的原后分离的原生质体才能分裂。生质体才能分裂。马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h48h后分离原后分离原生质体，才能获得
5、高产量。生质体，才能获得高产量。第6页，共75页，编辑于2022年，星期五原生质体分离的方法原生质体分离的方法机机 械械 分分 离离 法法酶酶 解解 分分 离离 法法第7页，共75页，编辑于2022年，星期五机械分离法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。出完整的原生质体。v缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类
6、受到能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。限制。v优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。破坏作用。第8页，共75页，编辑于2022年，星期五酶解分离法酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。生质体的方法。v常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类）、果胶酶
7、类（果胶酶和离析酶（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶）、蜗牛酶和胼胝质酶。和胼胝质酶。第9页，共75页，编辑于2022年，星期五酶来源生产厂家纤维素酶类Onozuka R-10绿色木霉Yakult Honsha Co.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,San Diego,CA 92037,USADriselaseIrpex lutensKayowa Hakko Kogyo Co.,Tokyo,Japan第10页，共75页，编辑于2022年，星期五酶来源生产厂家果胶酶类Macerozyme R-10根霉Yakult Honsha Co
8、.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉Sigma Chemical Co.Pectolyase Y-23黑曲霉Seishin Pharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉Rohm and Hass Co.,Rhiladelphia,UAS第11页，共75页，编辑于2022年，星期五酶解法的优缺点酶解法的优缺点v优点：获得量大，适用广泛。优点：获得量大，适用广泛。v缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。会影响所获原生质
9、体的活力。第12页，共75页，编辑于2022年，星期五沉沉 降降 法法漂漂 浮浮 法法不不 连连 续续 梯梯 度度 法法原生质体纯化的方法原生质体纯化的方法第13页，共75页，编辑于2022年，星期五飘浮法Protoplastv采用比原生质体密度大的高渗溶液采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、（蔗糖、Percoll、Ficoll），），使原使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。生质体漂浮在液体表层的纯化方法。v优点：优点：可以避免分离的原生质体因震荡可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。所用药品简单，成本低。v缺点及补救措施：缺点及补救措
10、施：对离心力要求比较严格，掌握不好，对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。度和不同离心速度分次漂浮的方法。第14页，共75页，编辑于2022年，星期五沉沉 降降 法法v利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。整的原生质体沉积于试管底部。v优缺点：优缺点：纯化原生质体比较简单。纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，
11、挤压，常引起原生质体的破碎。常引起原生质体的破碎。第15页，共75页，编辑于2022年，星期五v又称界面法，采用两又称界面法，采用两种密度不同的溶液形种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过成不连续梯度，通过离心使原生质体与破离心使原生质体与破损细胞分别处于不同损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原液相中，从而纯化原生质体的方法。生质体的方法。v优点：可以收集到数优点：可以收集到数量较大的纯净原生质量较大的纯净原生质体，同时避免收集过体，同时避免收集过程中原生质体因相互程中原生质体因相互挤压而破碎。挤压而破碎。12mL碎片带碎片带含原生含原生质体带质体带0.6mL 0.45M蔗糖蔗糖0.45M甘甘露
12、醇露醇不连续梯度法第16页，共75页，编辑于2022年，星期五第17页，共75页，编辑于2022年，星期五第18页，共75页，编辑于2022年，星期五原原 生生 质质 体体 鉴鉴 定定v低渗爆破法低渗爆破法v荧光增白剂法荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)第19页，共75页，编辑于2022年，星期五原原 生生 质质 体体 活活 力力 测测 定定v形态识别形态识别 形态完整、富含形态完整、富含细胞质、颜色新细胞质、颜色新鲜的正常球形，鲜的正常球形，放入低渗溶液中，放入低渗溶液中，可正常膨大。可正常膨大。第20页，共75页，编辑于2022年，星期五原原 生生 质质 体体 活
13、活 力力 测测 定定v荧光显微镜识别荧光显微镜识别(FDA法法)FDA(fluorescein diacetate)本本身不发荧光也不具有极身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内膜。活细胞内FDA可以可以被酯酶裂解，将能发荧被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞质膜，在完整的活细胞内积累内积累。使用浓度：使用浓度：0 0.01%01%第21页，共75页，编辑于2022年，星期五原原 生生 质质 体体 活活 力力 测测 定定v酚藏花红染色法（酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能
14、使无活力的原生酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。质体不着色。v伊凡蓝伊凡蓝(Evans blue)染色法染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。取这种染料，活细胞不摄取。v氧电极法氧电极法第22页，共75页，编辑于2022年，星期五影响原生质体数量和活力的因素影响原生质体数量和活力的因素v供试材料及预处理方法供试材料及预处理方法v酶解条件：酶解条件：酶质量、组合、浓度、酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度、光照和温度v渗透压稳定剂渗透压稳定剂v质膜稳定剂质膜稳定剂v
15、分离条件：分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。时间。v分离用具分离用具 第23页，共75页，编辑于2022年，星期五酶的种类、组合、浓度酶的种类、组合、浓度材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶蜗牛酶研究者烟草叶片禾谷类叶片油菜花粉马铃薯子叶马铃薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.10.20.50.51.0UchimiyaScott李仕琼戴朝曦王蒂几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)第24页，共75页，编辑于2022年，星期五材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶
16、离析酶研究者枸杞愈伤组织檀香幼叶檀香愈伤组织榆幼叶山毛榉幼叶胡杨悬浮细胞0.52.01.00.10.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.010.030.11.00.20.50.5孙勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja诸葛强几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)第25页，共75页，编辑于2022年，星期五pHpHv分离原生质体时，酶液的分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。值是不一致的。v如制备菜
17、豆叶片原生质体时：如制备菜豆叶片原生质体时：低低pH（40%40%）交变电场的振幅频率交变电场的振幅频率100 V/cm交变电场处理时间交变电场处理时间20s支流高频电压支流高频电压1100V/cm脉冲宽度脉冲宽度60us脉冲次数脉冲次数1第53页，共75页，编辑于2022年，星期五融融 合合 类类 型型v自发融合自发融合v诱发融合诱发融合v对称融合对称融合v非对称融合非对称融合 核失活核失活细胞质失活细胞质失活FlashFlash第54页，共75页，编辑于2022年，星期五影响原生质体融合的因素影响原生质体融合的因素v原生质体质量至关重要，高质量的原生质体原生质体质量至关重要，高质量的原生质
18、体是细胞融合的首要条件。是细胞融合的首要条件。v融合方法融合方法v融合参数，包括各种融合液都应选择适当。融合参数，包括各种融合液都应选择适当。第55页，共75页，编辑于2022年，星期五融融 合合 体体 类类 型型v异核体异核体(heterokaryon)或异核细胞或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞 v同核体同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞 v非对称杂种或细胞质杂种非对称杂种或细胞质杂种第56页，共75页，编辑于2022年，星期五细胞质工程细胞质工程(cytoplasmic eng
19、ineering)v细胞质工程细胞质工程 又称细胞拆合工程又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。胞。v可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。究和育种工作。第57页，共75页，编辑于2022年，星期五细胞质工程细胞质工程v细胞质杂种细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起物质与一个特定的核基因组结合在一起细胞质
20、杂种获得途径（细胞质杂种获得途径（4条）：条）：v一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（等（1981）用密度梯度离心（）用密度梯度离心（550%Percoll，2000040000g，4090min）获得高）获得高纯度的去核原生质体。纯度的去核原生质体。第58页，共75页，编辑于2022年，星期五细胞质工程细胞质工程v细胞质杂种获得途径细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合v使核失活的方法：使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消
21、失；异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。较晚时期，染色体选择性消失。第59页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径v细胞器移植细胞器移植叶绿体移植叶绿体移植v叶绿体的来源叶绿体的来源叶片机械法低速离心叶片机械法低速离心原生质体低渗涨破低速离心原生质体低渗涨破低速离心v叶绿体的纯化叶绿体的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心或蔗糖密度梯度离心v叶绿体的转移叶绿体的转移 夹层离心法和夹层离心法和PEG诱导融合诱导融合应用应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体利用叶绿体的转移使低光效作物的原
22、生质体通过利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。第60页，共75页，编辑于2022年，星期五v细胞器移植细胞器移植细胞核移植细胞核移植v细胞核的来源细胞核的来源植物组织机械法植物组织机械法（加（加Triton X-100）过滤离心过滤离心原生质体低渗涨破原生质体低渗涨破(加加Triton X-100)过滤离心过滤离心v细胞核的纯化细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心或蔗糖密度梯度离心v细胞核的转移细胞核的转移 夹层离心法：原生质体核原生质体核夹层离心法：原生质体核原生质体核 PEG诱导诱导 电场诱导和
23、微注射电场诱导和微注射体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径第61页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径v微生物移植微生物移植内吞作用内吞作用摄入固氮根瘤菌摄入固氮根瘤菌v外源染色体和外源染色体和DNA的的摄入摄入染色体分离染色体分离v细胞同步化处理原生质体涨破差速离心细胞同步化处理原生质体涨破差速离心（200 g,10 min200 g,10 min；1000g1000g，20 min20 min）转移方法转移方法vPEGPEG诱导，显微注射诱导，显微注射v农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波
24、，激光穿孔第62页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据可见标记性状根据可见标记性状的的机械选择法机械选择法第63页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定。FITC(FITC(异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素)在荧光显徽镜在荧光显徽镜下呈绿色下呈绿色 RITC(RITC(异硫氰酸异硫氰酸罗丹明罗丹明)RITCRITC在荧在荧光显徽镜下呈红色光显徽镜下呈红色第64页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据其遗传和生理生化特性的根据
25、其遗传和生理生化特性的互补选择法互补选择法第65页，共75页，编辑于2022年，星期五互补选择法互补选择法v互补选择法互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性和生理特性,在特定培养条件下在特定培养条件下,只有发生互只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法抗性互补选择法营养代谢互补选择法营养代谢互补选择法生长互补生长互补选择法选择法矮牵牛矮牵牛+爬山虎融合体的选择爬山虎融合体的选择第66页，共75页，编辑于2022年，星期五原生质体原生质体矮牵牛矮牵牛爬山虎冠瘿爬山虎冠瘿混合体混合体融合处理融合处理矮牵牛
26、矮牵牛+爬山虎爬山虎细胞团细胞团愈伤组织愈伤组织（异核体）（异核体）NTNT培养基培养基MSMS培养基培养基(无激素无激素)NTNT培养基培养基NTNT培养基培养基细细 胞胞 团团MSMS培养基培养基(无激素无激素)死亡死亡MSMS培养基培养基(有激素有激素)愈伤组织愈伤组织原生质体原生质体细胞团细胞团MSMS培养基培养基(无激素无激素)死亡死亡愈伤组织愈伤组织第67页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v细胞学鉴定细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和细
27、胞杂种的染色体数目、形态和带型带型进行观察。进行观察。第68页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v同功酶鉴定同功酶鉴定根据亲本和杂种同根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定本谱带。常用的鉴定酶为：酶为：乙醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。物酶、酯酶等。第69页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定vDNA分子
28、标记鉴定分子标记鉴定是在是在DNA水平上对水平上对亲本和杂种植株遗传亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种差异进行鉴定的一种技术。技术。依据依据DNA的多态性的多态性（polymorphism）Random Amplified Polymorphic DNA第70页，共75页，编辑于2022年，星期五体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定第71页，共75页，编辑于2022年，星期五小结小结v原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是进行各种细胞操作的理想系统。进行各种细胞操作的理想系统。v原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的原生质体的分离和纯
29、化是对其操作和培养的前提。前提。v分离的原生质体活性受供体材料和分离条件分离的原生质体活性受供体材料和分离条件的影响。的影响。v原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技术成熟程度直接影响体系的应用。术成熟程度直接影响体系的应用。第72页，共75页，编辑于2022年，星期五小结小结v原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。v体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。具有深远意义。v原生质体融合技术主要有原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合融合及电融合v提高融合效率和
30、融合细胞培养重复性是该技术研提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技术研究的重点究的重点第73页，共75页，编辑于2022年，星期五思考题思考题1原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。生质球的概念。2为什么原生质体要培养在等渗培养基中？为什么原生质体要培养在等渗培养基中？3影响原生质体培养的主要因素。影响原生质体培养的主要因素。4原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点5为什么说原生质体培养系统是现代生物技术为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？的载体？第74页，共75页，编辑于2022年，星期五思考题思考题6植物体细胞杂交的概念和类型。植物体细胞杂交的概念和类型。7.什么是细胞质工程？什么是细胞质工程？8对称融合和非对称融合的概念及非对称融对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。合的作用。9PEG融合与电融合的原理及影响因素。融合与电融合的原理及影响因素。10杂种细胞的获得和选择方法。杂种细胞的获得和选择方法。第75页，共75页，编辑于2022年，星期五