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1、实验九质粒的制备第1页，共14页，编辑于2022年，星期五一实验目的一实验目的1.掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。2.掌握DNA分离纯化的基本操作技能。第2页，共14页，编辑于2022年，星期五二实验背景二实验背景w质粒是细菌染色体外的环形双链DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。w大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。大小可从1kb到200kb。第3页，共14页，编辑于2022年，星期五w质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。w质粒的存在使宿主具有
2、一些额外的特性，如对抗生素的抗性或致育因子等。第4页，共14页，编辑于2022年，星期五质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 和 严紧型质粒1.松弛型质粒 其复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。质粒的拷贝数通常很高，有的甚至可达2000-3000拷贝/细胞。第5页，共14页，编辑于2022年，星期五2.严紧型质粒 严紧型质粒的复制受到严格控制，其拷贝数通常很低，每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子。第6页，共14页，编辑于2022年，星期五质粒的应用w大多数基因工程使用松弛型质粒。w严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。w质粒的特点使质粒
3、成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。第7页，共14页，编辑于2022年，星期五分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有：w碱变性法；w煮沸法；w 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。第8页，共14页，编辑于2022年，星期五三、实验原理碱变性法基本原理w碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达
4、到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。而质粒DNA仍为可溶状态留在上清中。第9页，共14页，编辑于2022年，星期五w差速离心（differential centrifugation）是利用不同离心速度产生的不同离心力，将沉
5、降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开。w用于分离大小、形状显著不同的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离.w特点：（1）介质密度均一；（2）速度由低向高，逐级离心。w沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高尔基体核蛋白体。w可将大小相差悬殊的细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。差速离心差速离心第10页，共14页，编辑于2022年，星期五差速离心差速离心高速高速低速低速第11页，共14页，编辑于2022年，星期五四、操作步骤第12页，共14页，编辑于2022年，星期五第13页，共14页，编辑于2022年，星期五思考题w解释操作过程中第4，5，6，7，11步的作用w解释差速离心第14页，共14页，编辑于2022年，星期五