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1、关于核酸合成1第1页，讲稿共110张，创作于星期二2分子生物学分子生物学(分子遗传学分子遗传学)中心法则中心法则 反映了从反映了从DNADNARNARNA蛋白质的遗传信息主流，蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律规律。转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质DNA RNA（病毒）（病毒）复制复制复制复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒）反转录反转录第2页，讲稿共110张，创作于星期二3 复制：复制：亲代亲代DNA或或RNA在一系列酶的作用下在一系列酶的作用下,生成生成与亲代相同的子代与亲代相同的子代DNA或或RNA的过程。
2、的过程。转录：转录：以以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给的遗传信息传给RNA，形成一条与，形成一条与DNA链互补的链互补的RNA的过程。的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNA为模板，将为模板，将mRNA 的密的密码解读成蛋白质的码解读成蛋白质的AA顺序的过程。顺序的过程。逆转录：逆转录：以以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生为模板，在逆转录酶的作用下，生成成DNA的过程。的过程。第3页，讲稿共110张，创作于星期二4中心法则的遗传流向有中心法则的遗传流向有5条途径条途径 1、DNADNA：DNA复制复制 （以（以DNA为模板合
3、成为模板合成DNA）2、RNA RNA：RNA复制复制 （以（以RNA为模板合成为模板合成RNA）3、DNA RNA：DNA转录转录 （以（以DNA为模板合成为模板合成RNA）4、RNA DNA：反反(逆逆)转录转录 （以（以RNA为模板合成为模板合成DNA）5、RNA Protein：翻译翻译第4页，讲稿共110张，创作于星期二5Reverse transcription第5页，讲稿共110张，创作于星期二6第一节第一节 DNADNA的生物合成的生物合成一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制二、与二、与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质三、三、DNADNA的复制过程的
4、复制过程四、逆转录四、逆转录五、五、DNADNA的损伤修复的损伤修复第6页，讲稿共110张，创作于星期二7DNA的生物合成方式&DNADNA DNA复制复制&RNADNA 反转录反转录两种方式两种方式第7页，讲稿共110张，创作于星期二8一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制定义：定义：由亲代由亲代DNADNA生成子代生成子代DNADNA时，每个新形成的子代时，每个新形成的子代DNADNA中，中，一条链来自亲代一条链来自亲代DNADNA，而另一，而另一条链则是新合成的，这种复制条链则是新合成的，这种复制方式叫方式叫半保留复制半保留复制.半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据:19581
5、958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记大肠杆菌标记大肠杆菌DNA,DNA,首先证首先证明了明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。第8页，讲稿共110张，创作于星期二9细菌的细菌的DNA双链双链(蓝蓝线的代表含线的代表含15N)含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液第一代第一代重重DNA普通普通DNA普通普通DNADNA半保留复制的证据半保留复制的证据可排除全保留式可排除全保留式Why?第9页，讲稿共110张，创作于星期二10混合式混合式重重DNA普通普通DNA重重DNA第二代第二代半保留半保留式式第一代
6、第一代故可排除混合式复制方故可排除混合式复制方式式第10页，讲稿共110张，创作于星期二11培养第一代培养第一代结果结果重重DNA普通普通DNA母链母链全保留式全保留式半保留式半保留式混合式混合式重重DNA普通普通DNA排除全保留式排除全保留式第11页，讲稿共110张，创作于星期二12细菌的细菌的DNA双链双链(蓝蓝线的代表含线的代表含15N)(红红线的代表含线的代表含14N)含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液第二代第二代重重DNA第一代第一代重重DNA普通普通DNA普通普通DNADNA半保留复制的证据半保留复制的证据排除混
7、合式排除混合式Why?第12页，讲稿共110张，创作于星期二131515N-DNAN-DNA的密度大于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度第13页，讲稿共110张，创作于星期二14DNADNA的半保留复制的生物学意义：的半保留复制的生物学意义：DNA DNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNADNA是是一种惰性物质。一种惰性物质。DNADNA的半保留复制表明的半保留复制表明DNADNA在代谢上的在代谢上的稳定性稳定性，是，是保证亲代的遗传信息稳定地传保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。递给后代必要措施。第14页，讲稿共110张，创作于星期二15&必须具备的基
8、本条件模板模板：母链：母链DNADNA原料原料：dNTP(dNTP(包括包括dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTP)dTTP)引物引物：一小段：一小段RNA RNA 能量能量（ATPATP）及某些）及某些无机离子无机离子酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子：第15页，讲稿共110张，创作于星期二16二、参与二、参与DNADNA复制的复制的 酶类与蛋白质因子酶类与蛋白质因子1.1.拓扑异构酶拓扑异构酶2.2.解链酶解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶又称解螺旋酶或螺旋酶3.3.单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白4.4.引物酶引物酶5.DNA5.DNA聚合酶聚合酶6.DNA6.DNA连接
9、酶连接酶第16页，讲稿共110张，创作于星期二171.拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）切割切割(断断)双链双链DNA中的中的一链一链，松解螺旋，松解螺旋,封闭切口。又称封闭切口。又称切割封口酶切割封口酶。不需耗能。不需耗能(ATP)，Topo 的作用的作用第17页，讲稿共110张，创作于星期二18Topo(又称旋转酶又称旋转酶)的作用的作用 无无ATP时时：作用相当于：作用相当于Topo,但切割的但切割的是是双链双链DNA某一部位某一部位(断双链断双链)。有有ATP时时：使带断口、松弛状的：使带断口、松弛状的DNA分子分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。旋紧转变成负超螺旋
10、结构，再连接断端。第18页，讲稿共110张，创作于星期二19第19页，讲稿共110张，创作于星期二202.解链酶解链酶(又称又称解螺旋酶或螺旋酶解螺旋酶或螺旋酶,helicase)解链酶 作用作用：断裂互补碱基间的氢键：断裂互补碱基间的氢键,使使DNADNA双链双链分离形成分离形成“复制叉复制叉”。第20页，讲稿共110张，创作于星期二21ABC拓扑异拓扑异 构酶构酶II+ATP拓扑异拓扑异 构酶构酶IDNA的松弛状态与超螺旋的松弛状态与超螺旋第21页，讲稿共110张，创作于星期二22参与参与DNA复制的酶复制的酶与蛋白因与蛋白因子总览图子总览图第22页，讲稿共110张，创作于星期二23 3.
11、单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(DNA结合蛋白结合蛋白)(single stranded DNA-binding protein,SSB)(single stranded DNA-binding protein,SSB)作用作用：防止重新形成双防止重新形成双 链和防止单链模板链和防止单链模板被核酸酶水解被核酸酶水解,维持维持DNA单链状态和完整性单链状态和完整性 第23页，讲稿共110张，创作于星期二244.引物酶(Primase)5RNA引引物物53 5RNA引引物物53RNA的合成：需引物的合成：需引物酶，它是一种特殊的酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。聚合酶。DNA不不能从无能从无有有合成
12、，需在合成，需在一小段一小段RNA基础上合成基础上合成DNA第24页，讲稿共110张，创作于星期二255 5。DNADNA聚合酶聚合酶:.以以DNADNA为模板的为模板的DNADNA合成酶，其催化反应的特点合成酶，其催化反应的特点 （1 1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物（2 2）反应需要有模板的指导；）反应需要有模板的指导；（3 3）反应需要有）反应需要有3 3-OH-OH存在；存在；（4 4）DNADNA链的合成方向为链的合成方向为5 5 3 3 N3 5 5 OOH OH PPP-O-CH2OH 生物大分子合成：生物大分子合成：底物、酶、能量、模板第25页，讲
13、稿共110张，创作于星期二26（5 5）DNADNA聚合酶的反应可以利用聚合酶的反应可以利用DNADNA双链作为双链作为模板和引物，亦可以单链模板和引物，亦可以单链DNADNA作为模板和引物作为模板和引物（6 6）DNADNA的体外聚合必须加入少量的的体外聚合必须加入少量的DNADNA才能才能进行。进行。DNADNA在提取过程中易形成切口（在提取过程中易形成切口（nicknick）或缺口（或缺口（gapgap）.则加入的则加入的DNADNA一条链作为模板而一条链作为模板而另一条链可作为引物。另一条链可作为引物。第26页，讲稿共110张，创作于星期二27在大肠杆菌中发现有三种在大肠杆菌中发现有三
14、种DNADNA聚合酶（聚合酶（用突变株研用突变株研究其功能究其功能）：）：分别命名为分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol），DNA聚合酶聚合酶（pol），DNA聚合酶聚合酶（pol），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol 和pol 关于关于 原核生物中的原核生物中的DNA聚合酶聚合酶第27页，讲稿共110张，创作于星期二28 DNA DNA聚合酶聚合酶:单体酶单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是O-O-二氮杂二氮杂菲），多功能酶。功能有三：菲），多功能酶。功能有三：第一：第一：它具有它具
15、有5 5 3 3 聚合酶功能聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；（对脱氧核苷酸的选择）；第二：第二：33 5 5外切酶活性外切酶活性（对双链无作用，（对双链无作用，校对功能。校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）第三：第三：5 5 33外切酶活性外切酶活性（双链有效，主要是对（双链有效，主要是对DNADNA损伤的修复，以及在损伤的修复，以及在DNADNA复制时复制时RNARNA引物切除及其空隙引物切除及其空隙的填补）；的填补）；在在DNADNA链的链的3 3 形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐
16、与磷酸盐与dNTPdNTP之间的焦磷酸基交换。之间的焦磷酸基交换。第28页，讲稿共110张，创作于星期二29pol pol 为为具具有有三三种种酶酶活活性性的的单单一一肽肽链链的的大大分分子子蛋蛋白白质质，可可被被特特异异的的蛋蛋白白酶酶水水解解为为两两个个片片段段，其其中中的的大大片片段段保保留留了了两两种种酶酶活活性性,即即5353聚聚合合酶酶和和3535外外切切酶酶活活性性，通通常常被称为被称为Klenow fragmentKlenow fragment。Klenow片段的分子结构片段的分子结构第29页，讲稿共110张，创作于星期二30DDDP 53聚合作用示意图聚合作用示意图3 模板链
17、模板链 5 53第30页，讲稿共110张，创作于星期二31DDDP 的的 53外切及外切及35外切外切作用示意图作用示意图35外切外切5 3外切外切53CA3第31页，讲稿共110张，创作于星期二32 DNA DNA聚合酶聚合酶：多亚基酶，多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；聚合作用，但聚合活力很低；具有具有3 3 5 5外切酶活性。其它生理功能外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNADNA损损伤中起作用。伤中起作用。第32页，讲稿共110张，创作于星期二33 DNA DNA聚合酶聚合酶：是原核生物是原核生物DNADNA复制的主要聚合酶复制
18、的主要聚合酶，该酶由，该酶由1010种亚基组种亚基组成，其中成，其中、形成全酶的核心酶形成全酶的核心酶。具有具有553DNA3DNA聚合酶活性聚合酶活性（亚基，亚基，速率高）；速率高）；具有具有33 5 5外切酶外切酶（亚基）亚基）的校对功能，提高的校对功能，提高DNADNA复制的复制的保真性；保真性；具有具有55 33外切酶活性外切酶活性（单链有效，其意义未知）。（单链有效，其意义未知）。（4 4）DNADNA聚合酶聚合酶IVIV和和V V：19991999年发现，当年发现，当DNADNA严重损伤时，诱导产生。严重损伤时，诱导产生。第33页，讲稿共110张，创作于星期二34pol pol 由
19、由十十种种亚亚基基组组成成不不对对称称异异源源二二聚聚体体结结构构，其其中中 亚亚基基具具有有5353聚聚合合DNADNA的的酶酶活活性性，具具有有复复制制DNADNA的的功功能能；而而 亚亚基基具具有有3535外外切切酶酶的的活活性性，与与DNADNA复复制制的校正功能有关。的校正功能有关。第34页，讲稿共110张，创作于星期二35 原核生物中的三种DNA聚合酶pol pol pol 53聚合酶活性+53外切酶活性+-35外切酶活性+生理功能填补缺口修复损伤校正错误未知复制DNA校正错误第35页，讲稿共110张，创作于星期二36 DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA
20、DNA聚合酶聚合酶亚基数目亚基数目 1 1（单体酶）（单体酶）1 1（多亚基酶）（多亚基酶）1 1（多亚基酶）（多亚基酶）5 35 3聚合活性聚合活性 +中中 +很低很低 +很高很高3 53 5外切活性外切活性 +（保护（保护DNADNA复制的复制的忠实性忠实性fidelityfidelity）5 35 3外切活性外切活性 +-+-主要是对主要是对DNADNA损伤的修复；损伤的修复；以及在以及在DNADNA复制时切除复制时切除RNARNA引物并填补其留下的引物并填补其留下的空隙。空隙。修复紫外光引起的修复紫外光引起的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，还具有聚合酶，
21、还具有3-5 3-5 外切酶的外切酶的校对功能，提高校对功能，提高DNADNA复制的保真性复制的保真性第36页，讲稿共110张，创作于星期二37在在真核生物真核生物中，目前发现的中，目前发现的DNA聚合酶有五种聚合酶有五种:DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。DNA-pol 在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。DNA-pol
22、 第37页，讲稿共110张，创作于星期二38真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol分子量(kD)16.54.014.012.525.553聚合酶活性+?+35外切酶活性-+生理功能起始引发引物酶活性低保真度复制线粒体DNA复制延长子代链的主要酶,解螺旋酶活性填补缺口,切除修复,重组第38页，讲稿共110张，创作于星期二39 在真核细胞内有五种在真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶（与细菌（与细菌DNADNA聚聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）定位定位 细胞核细胞核 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞核细胞核 细胞核细
23、胞核3-53-5外切外切 -+-+酶活性酶活性功能功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制修复修复作用作用第39页，讲稿共110张，创作于星期二406.DNA.DNA连接酶（连接酶（19671967年发现）：年发现）：若双链若双链DNADNA中一条链有切口，一端是中一条链有切口，一端是3-OH3-OH，另一端是，另一端是5-5-磷酸磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的但是它不能将两条游离的DNADNA单链连接起来。单链连接起来。大肠杆菌和其
24、它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶要求连接酶要求NADNAD+提供能量，在高提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求等生物和噬菌体中，则要求ATPATP提供能量。提供能量。T4T4噬菌体的噬菌体的DNADNA连接酶连接酶不仅能在模板链上连接不仅能在模板链上连接DNADNA和和DNADNA链之间的切口，链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNADNA。3535OHOHP P第40页，讲稿共110张，创作于星期二41作用：在有模板指导的条件下，催化2个DNA片段(两片段间的距离为1个3,5-磷酸二酯键的键长)的连接。原理：在一个DNA片段的3
25、-OH末端和另一个DNA片段的5-P末端形成3,5-磷酸二酯键，从而实现连接。特点：原核细胞:需辅助因子NAD+真核细胞:不需辅助因子NAD+,但需耗能(ATP)第41页，讲稿共110张，创作于星期二42连接酶的反应机制连接酶的反应机制：酶酶 +NAD+NAD+(ATP)(ATP)酶酶-AMP+-AMP+烟酰胺单核苷酸烟酰胺单核苷酸（PPiPPi）酶酶-AMP+P-5-DNA -AMP+P-5-DNA 酶酶 +AMP-P-5-DNA+AMP-P-5-DNADNA-3-OH+AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA-3-OH+AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+
26、AMPDNA+AMPvDNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用重要作用作用第42页，讲稿共110张，创作于星期二43 双链的解开双链的解开 RNARNA引物的合成引物的合成 DNADNA链的延伸链的延伸 切除切除RNARNA引物，填补引物，填补缺口，连接相邻的缺口，连接相邻的DNADNA片段片段三、三、DNADNA的复制过程的复制过程（以大肠杆菌为例）（以大肠杆菌为例）第43页，讲稿共110张，创作于星期二44一些概念：一些概念：v DNADNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点。常用
27、。常用ori(ori(或或o o）表示。许多生物的复制原点都是富含）表示。许多生物的复制原点都是富含A A、T T的的区段。区段。v大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA以及真核生物的细胞器以及真核生物的细胞器DNADNA为双链环为双链环状，只有状，只有一个一个复制原点，复制原点，v而真核生物染色体而真核生物染色体DNADNA是线性双链分子，含有是线性双链分子，含有许多许多复制复制起点。起点。？意义如何？意义如何？v从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制子（基因组独立进行复制的单位）（基因组独立进行复制的单位）。第44页，讲稿共110张，创作于
28、星期二451 复制的起始复制的起始v复制原点复制原点由由DnaADnaA蛋白识别，蛋白识别，在原点由在原点由DnaBDnaB蛋白（解蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链互补链(DNA(DNA双链的解开还需双链的解开还需DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 、SSB)SSB),在在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。v DNADNA复制复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点点(growth point)(growth point)，叫，叫复制叉
29、复制叉。在复制叉上分布着各种。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制复制体（体（replisomereplisome）复制叉复制叉复制叉复制叉第45页，讲稿共110张，创作于星期二4653oriorioriori535533553复制子复制子3复制起始点与复制子示意图复制起始点与复制子示意图第46页，讲稿共110张，创作于星期二47oriterA B CA.环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B.复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C.复制接近终止点复制接近终止点(termination,ter)DNADN
30、A的双向复制示意图的双向复制示意图第47页，讲稿共110张，创作于星期二48复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3535DNA的双向复制的双向复制第48页，讲稿共110张，创作于星期二493 5 3 5 3535解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)DNADNA的半不连续复制的半不连续复制35第49页，讲稿共110张，创作于星期二50(1)互相缠绕的双链母本互相缠绕的双链母本DNA，复制从特定，复制从特定的位置的位置(复制原点复制原点Ori or O)开始，开始，该位置该位置常是富含常是富含A、T区段。区段。第5
31、0页，讲稿共110张，创作于星期二51细菌和酵母菌中细菌和酵母菌中DNADNA复制起始点的碱基序列复制起始点的碱基序列第51页，讲稿共110张，创作于星期二52(2)(2)DNA DNA 解螺旋酶解螺旋酶(DnaB)(DnaB)打开局部双链，通过水解打开局部双链，通过水解ATPATP将将DNADNA两条链打开。两条链打开。E.coliE.coli中的中的reprep蛋白就是解螺旋酶，还有蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶解螺旋酶I I、II II、IIIIII。每解开一对碱基需要水解。每解开一对碱基需要水解2 2个个ATPATP分子。分子。reprep蛋白沿蛋白沿3 3 55移动，而解螺旋酶移动，
32、而解螺旋酶I I、II II、IIIIII沿沿5 5 33移动。移动。(3)(3)单链结合蛋白单链结合蛋白(SSB-single-strand binding protein)(SSB-single-strand binding protein)：稳定已被解开的稳定已被解开的DNADNA单链，阻止复性和保护单链不被单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。核酸酶降解。然后在然后在DNADNA旋转酶旋转酶（TOP)TOP)的作用下，使螺旋的作用下，使螺旋DNADNA局局部变成松弛态。部变成松弛态。第52页，讲稿共110张，创作于星期二53(4)(4)引发前体引发前体:它由多种蛋白质它由多种蛋白质d
33、naAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、nn、nn和和i i组成。组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链55 3 3方向移动方向移动,具有识别具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNARNA引物的合成。引物的合成。移动和引发均需要移动和引发均需要ATPATP提供能量，提供能量，nn蛋白具有蛋白具有ATPATP酶酶的活力。引发体的移动与的活力。引发体的移动与复制叉复制叉移动的方向相同，与移动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成方向相反。的合成方
34、向相反。第53页，讲稿共110张，创作于星期二54第54页，讲稿共110张，创作于星期二55第55页，讲稿共110张，创作于星期二56第56页，讲稿共110张，创作于星期二57第57页，讲稿共110张，创作于星期二58(5)(5)起始因子、引物酶、起始因子、引物酶、DNADNA聚合酶聚合酶等随后结合，复制等随后结合，复制开始。开始。第58页，讲稿共110张，创作于星期二59(6)拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)：催化催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重重组修复和其他转变方面起重要作用。组修复和其他转变方面起重要作用。拓扑异构酶拓扑
35、异构酶：使使DNA一条链发生断裂和再连接。一条链发生断裂和再连接。作用作用是松解负超螺旋是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。转录区，同转录有关。拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNA两条链发生断裂和再连接。两条链发生断裂和再连接。当引当引入负超螺旋入负超螺旋时需要由时需要由ATP提供能量，同复制有关。提供能量，同复制有关。二者共同控制二者共同控制DNA的拓扑结构。的拓扑结构。第59页，讲稿共110张，创作于星期二601010 8 8 局部解链局部解链后后DNADNA复制过程中正超螺旋复制过程中正超螺旋的形成的形成人类拓扑异构酶人类拓扑异构
36、酶的分子的分子结构结构第60页，讲稿共110张，创作于星期二61解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成第61页，讲稿共110张，创作于星期二62 引发体在复制叉上移动，沿模板链引发体在复制叉上移动，沿模板链5 35 3的的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点，位点，DnaBDnaB蛋白活化引物合成酶。引发蛋白活化引物合成酶。引发RNARNA引物的合成。引物的合成。领头链领头链先引发开始合成，以原来一条先引发开始合成，以原来一条DNADNA单链为模板单链为模板（3 3 5),5),按按5 5 3 3的方向合成一段的方向合成
37、一段RNARNA引物引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至引物长度约为几个至1010个核苷酸，在引物的个核苷酸，在引物的55端含端含3 3个磷酸残基（个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸引物酶的底物是核苷三磷酸），），33端为端为游离的羟基。游离的羟基。2.2.引物引物RNARNA的合成的合成第62页，讲稿共110张，创作于星期二63在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷的催化下，以四种脱氧核糖核苷5-5-三磷三磷酸为底物，在酸为底物，在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯键连接上脱氧端以磷酸二酯
38、键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNADNA链的延伸同时进行领链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。头链和随后链的合成。两条链方向相反。在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚合酶聚合酶；而在真核生物中是而在真核生物中是DNA聚合酶聚合酶。领头链领头链 随后链随后链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈崎模型冈崎模型3 DNA3 DNA链的延伸链的延伸第63页，讲稿共110张，创作于星期二64 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol
39、DNADNA复制的延长过程复制的延长过程第64页，讲稿共110张，创作于星期二65领头链领头链在在DNA复制时，合成方向与复制复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。叉移动的方向一致并连续合成的链。随后链随后链在在DNA复制时，合成方向与复制复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的段，最后再连成一条完整的DNA链。链。半不连续复制半不连续复制在在DNA复制时，领头链是复制时，领头链是连续合成的连续合成的,而随后链的合成是不连续的，而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。这种复制方式称为半
40、不连续复制。第65页，讲稿共110张，创作于星期二66发现过程（发现过程（1968）：）：同位素实验，同位素实验，3HdT 短时间内为短时间内为DNA小片段小片段一段时一段时间后间后检测到检测到 DNA大片段。当用大片段。当用DNA连接酶的变异连接酶的变异株时，检测到大量株时，检测到大量DNA片段的积累。片段的积累。证明证明DNA复制中有小片段合成。复制中有小片段合成。测定测定DNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNA的一半。的一半。由于由于U替替代代dT，被尿嘧啶，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。糖基酶切除。在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，糖基酶的突变植株中，检测到一半
41、检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。标记出现在小片段（冈崎片段）中。第66页，讲稿共110张，创作于星期二67冈崎片段冈崎片段 在在DNADNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成断续的合成5 53 3 的多个短片段，这些不连续的小片段以的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。其发现者的名字命名为冈崎片段。冈崎片段：冈崎片段：真核生物中真核生物中100-200100-200个核苷酸（核小体的个核苷酸（核小体的DNADNA单单位）。原核生物中位）。原核生物中1000-20001000-2000个核苷酸
42、（相当于一个顺反个核苷酸（相当于一个顺反子）。子）。第67页，讲稿共110张，创作于星期二68第68页，讲稿共110张，创作于星期二69领头链的合成过程领头链的合成过程第69页，讲稿共110张，创作于星期二70随从链的合成过程随从链的合成过程第70页，讲稿共110张，创作于星期二71DNADNA聚合酶聚合酶催化领头链和随从链同时合成催化领头链和随从链同时合成第71页，讲稿共110张，创作于星期二72D DN NA A复复制制的的过过程程第72页，讲稿共110张，创作于星期二73第73页，讲稿共110张，创作于星期二74均以均以5 5/33/方向形成前导链和滞后链方向形成前导链和滞后链第74页，
43、讲稿共110张，创作于星期二75第75页，讲稿共110张，创作于星期二76第76页，讲稿共110张，创作于星期二77蛋白蛋白Mr亚基数亚基数功能功能SSB(单链结合蛋白单链结合蛋白)756004结合单链结合单链DNADnaB蛋白蛋白(解螺旋酶解螺旋酶)3000006DNA解螺旋解螺旋,引物体成分引物体成分DnaG蛋白蛋白(引物酶引物酶)600001RNA引物合成引物合成,引物体成分引物体成分DNA聚合酶聚合酶9000001820新链延长新链延长DNA聚合酶聚合酶I1030001除去引物除去引物,填充缺口填充缺口DNA连接酶连接酶740001连接连接DNA旋转酶旋转酶(DNA拓扑异拓扑异构酶构酶
44、)4000004超螺旋超螺旋参与链的延伸阶段的蛋白质和酶参与链的延伸阶段的蛋白质和酶第77页，讲稿共110张，创作于星期二78 当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3-OH3-OH端遇到上一个冈端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆（大肠杆菌有一个终止区）菌有一个终止区）。4.4.复制的终止复制的终止切除切除RNARNA引物，填补缺口，连接相邻的引物，填补缺口，连接相邻的DNADNA片段（复制片段（复制终止）终止）第78页，讲稿共110张，创作于星期二79这时会发生一系列变化：这
45、时会发生一系列变化：在在DNA聚合酶聚合酶催化下切除催化下切除RNA引物引物；留下的空隙由留下的空隙由DNA聚合酶聚合酶催化合成一段催化合成一段DNA填补上填补上；在在DNA连接酶连接酶作用下，连接相邻的作用下，连接相邻的DNA链；链；修复掺入修复掺入DNA链的错配碱基链的错配碱基；以以修复方式填补修复方式填补终止区终止区50-100bp的空缺。的空缺。这样以两条亲代这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成链为模板，各自形成一条新的一条新的DNA互补链。结果是形成了两个互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。双股螺旋分子。第79页，讲稿共110张，创作于星期二805 5 5 RNA酶酶OH
46、P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接第80页，讲稿共110张，创作于星期二81真核生物中真核生物中DNADNA的复制特点的复制特点1 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.200bp.3 3、真核生物、真核生物DNADNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速、真核生物染色体在全部复制完之前
47、起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。采用更多的复制起点。5 5、真核生物有多种、真核生物有多种DNADNA聚合酶。聚合酶。6 6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止染色体间的末端连接。结构，防止染色体间的末端连接。由由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 5 RNARNA引物切除后的填补，亦保持引物切除后的填补，亦保持端粒端粒的的一定长度一定长度。第81页，讲稿共110张，创作于星期二82复制叉复制叉复制叉复制叉终止区终止区
48、端粒结构端粒结构3 3 5 5 3 3 5 5 端端粒粒结结构构端粒酶是含端粒酶是含RNARNA的逆转录酶的逆转录酶第82页，讲稿共110张，创作于星期二83DNADNA复制的其它方式复制的其它方式大肠杆菌双链环状大肠杆菌双链环状DNADNA的复制的复制（一个复制起点，（一个复制起点，双向复制）双向复制）真核细胞线状染色体真核细胞线状染色体DNADNA的复制方式的复制方式（多个复（多个复制起点，双向复制）制起点，双向复制）单向滚环式复制单向滚环式复制（噬菌体（噬菌体 X174DNAX174DNA单链环状）单链环状）3 D-D-环式复制方式环式复制方式（线粒体双链环状（线粒体双链环状DNADNA
49、：两条链的复制起点不同：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）位置，且复制不同步）第83页，讲稿共110张，创作于星期二84v定义定义:以以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNADNA称称为逆转录，由为逆转录，由逆转录酶逆转录酶催化进行。催化进行。v19701970年年TeminTemin和和BaltimoreBaltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中分离出逆转录酶，迄病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌今已知的致癌RNARNA病毒都含有逆转录酶。病毒都含
50、有逆转录酶。用特异抑制物（放线菌素用特异抑制物（放线菌素D D）能抑制致癌）能抑制致癌RNARNA病毒的复制，病毒的复制，而对一般而对一般RNARNA病毒的复制无影响。已知放线菌素病毒的复制无影响。已知放线菌素D D专门专门抑制以抑制以DNADNA为模板的反应，可见致癌为模板的反应，可见致癌RNARNA病毒的复制过程病毒的复制过程必然涉及到必然涉及到DNADNA。所以所以TeminTemin于于19641964年提出前病毒的假说。年提出前病毒的假说。四、逆转录四、逆转录第84页，讲稿共110张，创作于星期二85病毒病毒RNARNA的逆转录过程的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞（以前