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1、关于基因工程与分子生关于基因工程与分子生物学常用技术物学常用技术第1页，讲稿共34张，创作于星期日第一节 基因工程与基因重组(Genetic Engineering and Genetic recombination)一、基因工程的基本概念一、基因工程的基本概念 不同来源的不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的重新组合的DNA分子，称为分子，称为DNA重组重组。将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为关的工
2、作统称为基因工程基因工程。第2页，讲稿共34张，创作于星期日(一一)工具酶工具酶1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (1)(1)能够切割能够切割能够切割能够切割DNADNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有选择地切割有选择地切割有选择地切割有选择地切割DNADNA分子特异序列的核酸酶，称为分子特异序列的核酸酶，称为分子特异序列的核酸酶，称为分子特异序列的核酸酶，称为限制性限制性限制性限制性核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶，简称限制性内切酶。，简称限制性内切酶。，
3、简称限制性内切酶。，简称限制性内切酶。(2)(2)命名命名命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第株的第三三种酶种酶(3)(3)识别特征识别特征识别特征识别特征5GAATTC33CTTAAG5 限制性内切酶识别限制性内切酶识别限制性内切酶识别限制性内切酶识别的的的的DNADNA序列具有序列具有序列具有序列具有回文回文回文回文结构结构结构结构特征。特征。特征。特征。第3页，讲稿共34张，创作于星期日 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不种不同的情
4、况：同的情况：产生产生产生产生3 3 突出粘性末端突出粘性末端突出粘性末端突出粘性末端：以：以：以：以EcoEcoR R为例：为例：为例：为例：5G5GAATTC3 AATTC3 5G5G AATTC3 AATTC33CTTAA3CTTAAG5 G5 3CTTAA3CTTAA G5 G5 产生产生产生产生5 5 突出粘性末端突出粘性末端突出粘性末端突出粘性末端：以：以：以：以PstPst为例：为例：为例：为例：5CTGCA5CTGCA G3 G3 5CTGCA5CTGCA G3 G33G3G ACGTC5 ACGTC5 3 G3 G ACGTC5 ACGTC5 产生产生产生产生平末端平末端平末
5、端平末端：NruNru为例：为例：为例：为例：5TCG5TCGCGA3 CGA3 5TCG5TCG CGA3 CGA3 3AGC3AGCGCT5 GCT5 3AGC3AGC GCT5 GCT5(4)(4)切割位点切割位点切割位点切割位点第4页，讲稿共34张，创作于星期日2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(1)(1)基因工程主要应用基因工程主要应用基因工程主要应用基因工程主要应用E.coli E.coli DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶、T4 DNAT4 DNA聚合酶和聚合酶和聚合酶和聚合酶和TaqTaq DNA DNA聚合酶等。聚合酶等。聚合酶等。聚合酶等。(2)(2)主要用途
6、：主要用途：主要用途：主要用途：利用利用利用利用5 5/33/聚合活性，合成聚合活性，合成聚合活性，合成聚合活性，合成DNADNA第二条链；第二条链；第二条链；第二条链；对对对对DNADNA的的的的3 3/端进行填补或末端标记；端进行填补或末端标记；端进行填补或末端标记；端进行填补或末端标记；E.coliE.coli DNA-pol DNA-pol用于缺口平移，制作探针；用于缺口平移，制作探针；用于缺口平移，制作探针；用于缺口平移，制作探针；T4 DNAT4 DNA聚合酶可用于聚合酶可用于聚合酶可用于聚合酶可用于DNADNA序列测定；序列测定；序列测定；序列测定；TaqTaq DNA DNA聚
7、合酶用于聚合酶链式反应聚合酶用于聚合酶链式反应聚合酶用于聚合酶链式反应聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)(PCR)。3.DNA3.DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。第5页，讲稿共34张，创作于星期日4.4.逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶(1)(1)用于真核用于真核用于真核用于真核mRNAmRNA逆转录，构建逆转录，构建逆转录，构建逆转录，构建cDNAcDNA文库。文库。文库。文库。(2)(2)用于进行用于进行用于进行用于进行3 3/端填补和标记
8、，制备端填补和标记，制备端填补和标记，制备端填补和标记，制备DNADNA探针。探针。探针。探针。(3)(3)用于用于用于用于DNADNA序列测定。序列测定。序列测定。序列测定。5.5.多核苷酸激酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (1)(1)用于放射性标记用于放射性标记用于放射性标记用于放射性标记DNADNA链的链的链的链的5 5/端。端。端。端。(2)(2)用于缺少用于缺少用于缺少用于缺少5 5/-磷酸基的磷酸基的磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化。磷酸化。磷酸化。磷酸化。6.6.碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶 此酶防止载体的自身连接。此酶防止载体的自身连接。此酶防止载体的自身
9、连接。此酶防止载体的自身连接。7.7.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 能催化单核苷酸转移到能催化单核苷酸转移到能催化单核苷酸转移到能催化单核苷酸转移到DNADNA的的的的3 3/-端羟基上。端羟基上。端羟基上。端羟基上。第6页，讲稿共34张，创作于星期日(二二)载体载体1.为为携携带带目目的的基基因因，实实现现其其无无性性繁繁殖殖或或表表达达有有意意义义的蛋白质所采用的一些的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。分子，称为载体。2.载体的选择标准载体的选择标准能自主复制。能自主复制。能自主复制。能自主复制。易进入宿主细胞。易进入宿主细胞。易进
10、入宿主细胞。易进入宿主细胞。具有多克隆位点。具有多克隆位点。具有多克隆位点。具有多克隆位点。易从宿主细胞中分离纯化。易从宿主细胞中分离纯化。易从宿主细胞中分离纯化。易从宿主细胞中分离纯化。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。质粒质粒噬菌体噬菌体粘粒粘粒粘粒粘粒病毒病毒3.常用载体常用载体第7页，讲稿共34张，创作于星期日质粒是细菌中独立于染质粒是细菌中独立于染质粒是细菌中独立于染质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制色质以外的、能自主复制色质以外的、能自主复制色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的、并与细菌或细胞共存的、并
11、与细菌或细胞共存的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，的遗传成分，的遗传成分，的遗传成分，可赋予宿主可赋予宿主细胞某些遗传性状。细胞某些遗传性状。通常质粒的大小为通常质粒的大小为通常质粒的大小为通常质粒的大小为2 2300kb300kb。一般只能容纳一般只能容纳一般只能容纳一般只能容纳10kb10kb的外的外的外的外源源源源DNADNA片断。片断。片断。片断。(1)(1)质粒质粒质粒质粒(plasmid)(plasmid)第8页，讲稿共34张，创作于星期日(2)(2)噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(bacteriophage(bacteriophage，phage)phage)噬菌体是感染细菌的一类病毒
12、，因其寄生在细菌中并噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNADNA注入注入注入注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外
13、。具有具有具有具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。第9页，讲稿共34张，创作于星期日(3)(3)粘粒粘粒粘粒粘粒(cosmid)(cosmid)粘粒本身约粘粒本身约粘粒本身约粘粒本身约4 4 6kb6kb，可克隆，可克隆，可克隆，可克隆DNADNA大片段，可用作建大片段，可用作建大片段，可用作建大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。立真核基因组文库的载体。立真核基因组文库的载体。立真核基因组文库的载体。粘粒是将粘粒是将粘粒是将粘粒是将 噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的coscos区与质粒组
14、合的装配型载区与质粒组合的装配型载区与质粒组合的装配型载区与质粒组合的装配型载体。体。体。体。(4)(4)病毒病毒病毒病毒 病毒载体更多病毒载体更多病毒载体更多病毒载体更多地用于真核表达系地用于真核表达系地用于真核表达系地用于真核表达系统，如腺病毒、痘统，如腺病毒、痘统，如腺病毒、痘统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒病毒、反转录病毒病毒、反转录病毒病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。和猴空泡病毒。和猴空泡病毒。和猴空泡病毒。第10页，讲稿共34张，创作于星期日二、重组二、重组DNA技术的基本原理和技术的基本原理和过程过程 基因工程中最主要是基因工程中最主要是基因工程中最主要是基因工程中最主要是分子克隆
15、分子克隆分子克隆分子克隆，克隆克隆克隆克隆是指由一个是指由一个是指由一个是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用的技术即重组采用的技术即重组采用的技术即重组采用的技术即重组DNADNA技术，故又称为分子克隆技术技术，故又称为分子克隆技术技术，故又称为分子克隆技术技术，故又称为分子克隆技术或基因工程技术。或基因工程技术。或基因工程技术。或基因工程技术。制备目的基因和相关载体；制备目的基因和相关载体；制备目的基因和相关载体；制
16、备目的基因和相关载体；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将重组的将重组的将重组的将重组的DNADNA导入受体细胞；导入受体细胞；导入受体细胞；导入受体细胞；DNADNA重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；DNADNA重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤第11页，讲稿共34张，创作于星期日(一一)目的基因的制备目的基因的制备1.1.制备基因组制备基因组制备基因组制备基因组DNADNA文库文库文库文库 (gen
17、omic library)(genomic library)将基因组将基因组将基因组将基因组DNADNA酶切成片段，再与载体分子拼接成重酶切成片段，再与载体分子拼接成重酶切成片段，再与载体分子拼接成重酶切成片段，再与载体分子拼接成重组组组组DNADNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。混合体称基因组文库。混合体称基因组文库。混合体称基因组文库。2.2.制备制备制备制备cDNAcDNA文库文库文库文库 (cDNA library)(cDNA libra
18、ry)将将将将mRNAmRNA逆转录合成逆转录合成逆转录合成逆转录合成cDNA cDNA，再与载体连接成重组，再与载体连接成重组，再与载体连接成重组，再与载体连接成重组DNADNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为的混合体称为的混合体称为的混合体称为cDNAcDNA文库。文库。文库。文库。第12页，讲稿共34张，创作于星期日3.3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)如已知目的基因序列，则可采用如已知目的基因序
19、列，则可采用如已知目的基因序列，则可采用如已知目的基因序列，则可采用PCRPCR从基因组从基因组从基因组从基因组DNADNA中获得目的基因，也可以采用逆转录中获得目的基因，也可以采用逆转录中获得目的基因，也可以采用逆转录中获得目的基因，也可以采用逆转录PCR(RT-PCR(RT-PCR)PCR)直接从直接从直接从直接从mRNAmRNA获得特定基因的获得特定基因的获得特定基因的获得特定基因的cDNAcDNA。4 4化学合成化学合成化学合成化学合成 如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密
20、码子推导出子推导出子推导出子推导出DNADNA的碱基序列，然后合成该段的碱基序列，然后合成该段的碱基序列，然后合成该段的碱基序列，然后合成该段DNADNA序列。序列。序列。序列。第13页，讲稿共34张，创作于星期日(二二)目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接1 1粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接2 2同聚物加尾连接同聚物加尾连接同聚物加尾连接同聚物加尾连接3 3平末端连接平末端连接平末端连接平末端连接4 4人工接头连接人工接头连接人工接头连接人工接头连接 将目的基因插入载体，用将目的基因插入载体，用将目的基因插入载体，用将目的基因插入载体，用DNADNA连接酶连接双链连接酶
21、连接双链连接酶连接双链连接酶连接双链DNADNA粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种：法主要有以下四种：法主要有以下四种：法主要有以下四种：第14页，讲稿共34张，创作于星期日(三三)将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞常用的方法有以下两种：常用的方法有以下两种：常用的方法有以下两种：常用的方法有以下两种：1.1.转化转化转化转化(transformation)(transformation)转化是指将质粒或其他外源转化是指将质粒或其
22、他外源转化是指将质粒或其他外源转化是指将质粒或其他外源DNADNA导入处于感受导入处于感受导入处于感受导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2.2.感染感染感染感染(infection)(infection)感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。宿主细胞中繁殖的过程。宿主细胞中繁殖的过程。宿主细胞中繁殖的过程。第15页，讲稿共34张，创
23、作于星期日1.1.遗传学方法遗传学方法遗传学方法遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因因因因(amprampr、tetr tetr、kanrkanr等等等等)和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方法。法。法。法。2.2.分子杂交方法分子杂交方法分子杂交方法分子杂交方法 利用利用利用利用3232P P标记的探针与重组标记的探针与重组标记的探针与重组标记的探针与重组DNADNA或克隆或克隆或克隆或克隆DNA
24、DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。3.3.免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。的方法筛选。的方法筛选。的方法筛选。(四四)目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定第16页，讲稿共34张，创作于星期日(五五)克隆基因的表达克隆基因的表达 利用重组利用重组利用重组利用重组DNADNA技
25、术所获得目的基因或技术所获得目的基因或技术所获得目的基因或技术所获得目的基因或DNADNA序列，可序列，可序列，可序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生实现在受体细胞中的表达，即产生实现在受体细胞中的表达，即产生实现在受体细胞中的表达，即产生mRNAmRNA或蛋白质产物。或蛋白质产物。或蛋白质产物。或蛋白质产物。(六六)重组重组DNA技术操作过程总结归纳技术操作过程总结归纳 分分切切接接转转筛筛分分离目的基因离目的基因 限制酶限制酶切切目的基因与载体目的基因与载体拼拼接接重组体重组体 转转入受体菌入受体菌 筛筛选重组体选重组体 第17页，讲稿共34张，创作于星期日2.特点特点 针对性强、特异性
26、强、灵敏度高、适应性针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。强。三、基因诊断和基因治疗三、基因诊断和基因治疗1.基因诊断是指基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。的方法。(一一)基因诊断基因诊断(gene diagnosis)3.3.应用应用应用应用遗传性疾病遗传性疾病遗传性疾病遗传性疾病肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤感染性疾病感染性疾病感染性疾病感染性疾病遗传易感性疾病遗传易感性疾病遗传易感性疾病遗传易感性疾病器官移植配型器官移植配型器官移植配型器官移植配型法医
27、学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定第18页，讲稿共34张，创作于星期日1.基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。疗疾病的方法。2.狭义狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法的方法。3.广义广义的基因治疗的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者是指将某种遗传物质转移到患
28、者细胞内，使其在体内发挥作用细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病以达到治疗疾病的方的方法法。(二二)基因治疗基因治疗(gene therapy)第19页，讲稿共34张，创作于星期日5.基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序(1)选择和制备目的基因：治疗性基因。选择和制备目的基因：治疗性基因。(2)选择选择基因转运载体：通常选择基因转运载体：通常选择病毒载体。病毒载体。(3)选择靶细胞：体细胞、生殖细胞。选择靶细胞：体细胞、生殖细胞。(4)转移基因：转移基因：将治疗基因导入并表达。将治疗基因导入并表达。4.基因治疗的基本策略基因治疗的基本策略基因增补基因增补基因置换基因置换基因矫正基因矫正基因
29、失活基因失活基因疫苗基因疫苗第20页，讲稿共34张，创作于星期日(The Technology and Application in Molecular Biology)(The Technology and Application in Molecular Biology)第二节 分子生物学 技术及其应用 核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)是指利用是指利用DNA复性原理，把不同来源的复性原理，把不同来源的DNA单链或单链或DNA与与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。则可形成杂化双链的
30、过程。一、核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术第21页，讲稿共34张，创作于星期日(一一)探针探针(probe)2.2.理想探针的特点理想探针的特点理想探针的特点理想探针的特点 (1)(1)带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；(2)(2)应是单链；应是单链；应是单链；应是单链；(3)(3)具有高度特异性；具有高度特异性；具有高度特异性；具有高度特异性；(4)(4)探针长度一般为数十至数千个碱基探针长度一般为数十至数千个碱基探针长度一般为数十至数千个碱基探针长度一般为数十至数千个碱基;(5)(5)
31、具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。1.1.探针是一段与被测的核苷酸序列探针是一段与被测的核苷酸序列探针是一段与被测的核苷酸序列探针是一段与被测的核苷酸序列(靶基因序列靶基因序列靶基因序列靶基因序列)互互互互补的带有标记的核苷酸片段。补的带有标记的核苷酸片段。补的带有标记的核苷酸片段。补的带有标记的核苷酸片段。第22页，讲稿共34张，创作于星期日(二二)核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的基本方法1.1.SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交 2
32、.2.(1)(1)指将经酶切和电泳分离的待测指将经酶切和电泳分离的待测指将经酶切和电泳分离的待测指将经酶切和电泳分离的待测DNADNA片段片段片段片段转印到固转印到固转印到固转印到固相支持物上，然后与标记的相支持物上，然后与标记的相支持物上，然后与标记的相支持物上，然后与标记的DNADNA探针杂交。探针杂交。探针杂交。探针杂交。3.3.(2)(2)可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面肿瘤研究和器官移植等方面肿瘤研究和器官移植等方面肿瘤研究和器官移植等方面。
33、2.Northern2.Northern印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交 (1)(1)指将经电泳分离后的待测指将经电泳分离后的待测指将经电泳分离后的待测指将经电泳分离后的待测RNARNA片段片段片段片段转印到固相支持转印到固相支持转印到固相支持转印到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。(2)(2)主要用于检测各种基因转录产物，主要是主要用于检测各种基因转录产物，主要是主要用于检测各种基因转录产物，主要是主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA mRNA。第23页，讲稿共34张
34、，创作于星期日第24页，讲稿共34张，创作于星期日3.3.斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 (1)(1)指将指将指将指将RNARNA或或或或DNADNA变性后直接点样于硝酸纤维变性后直接点样于硝酸纤维变性后直接点样于硝酸纤维变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，若采用狭缝
35、点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。称为狭缝印迹杂交。称为狭缝印迹杂交。称为狭缝印迹杂交。(2)(2)主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。定量研究。定量研究。定量研究。4.4.原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交 (1)(1)指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。或组织中的核酸进行杂交，称为原位
36、杂交。或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。(2)(2)该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。第25页，讲稿共3
37、4张，创作于星期日二、聚合酶链反应二、聚合酶链反应(一一)PCR的基本原理的基本原理 1.PCR有三个反应步骤有三个反应步骤DNA的变性的变性 DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)引物的延伸。引物的延伸。第26页，讲稿共34张，创作于星期日n个循环个循环加热变性加热变性模板模板DNA退火退火DNA延伸延伸P25 35 35 3 3P15 2.变性变性复性复性延伸这三个步延伸这三个步骤为一个循环，骤为一个循环，每次循环的产物每次循环的产物作为下个循环的作为下个循环的模板，如此循环模板，如此循环多次，多次，则则DNA成指数扩增。成指数扩增。第27页，讲稿共34张，创作于星期日PCR反应体系：
38、反应体系：1.引物引物 是是PCR特异性反应的关键，取决于引物与特异性反应的关键，取决于引物与模板模板DNA互补的程度。互补的程度。2.酶浓度酶浓度酶催化的酶催化的PCR反应的反应的Taq DNA聚合酶量约聚合酶量约需需2.5U。3.dNTP的质量的质量dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率扩增效率有密切关系，有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。失去生物学活性。4.模板核酸模板核酸的量与纯化程度是模板核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败成败与否的关键环节之一。与否的关键环节之一。(二二)PCR的基本反应的基本反应第28页
39、，讲稿共34张，创作于星期日1可分析基因转录产物；构建可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异文库；克隆特异cDNA；合成；合成cDNA探针。探针。2可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。点突变的检测和鉴定。3用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型序列分析；器官移植配型等。等。4应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。酸尿症
40、等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。5根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。于筛选特异的抗肿瘤化合物。(三三)PCR的应用的应用第29页，讲稿共34张，创作于星期日三、核酸的序列分析三、核酸的序列分析(一一)DNA链末端合成终止法链末端合成终止法(Sanger法法)第30页，讲稿共34张，创作于星期日采采用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段
41、上上的的荧荧光光分分子子发发出出不不同同波波长长荧荧光光，采采集集荧荧光光信信号号，确确定定DNA碱碱基基的的排排列顺序。列顺序。DNA自动测序结果举例自动测序结果举例(二二)DNA自动测序自动测序第31页，讲稿共34张，创作于星期日四、基因文库四、基因文库基因文库基因文库基因文库基因文库是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。包括基因组序列的克隆群体。包括基因组DNA文库和文库和cDNA文文库。库。五、生物芯片技术五、生物芯片技术(一一)基因芯片基因芯片(gene chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片段作为片段作为探针，
42、有规律地紧密排列固探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上定于单位面积的支持物上。包括。包括DNA芯片芯片(DNA chip)和和cDNA芯片芯片(cDNA chip)。第32页，讲稿共34张，创作于星期日是是将将蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，可可特特异异性性与与待待测测样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白反反应应，再再进进行行定定性性或或定定量分析的技术。量分析的技术。(二二)蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(三三)生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用主要应用于大量生物样品的快速、高效、灵敏的主要应用于大量生物样品的快速、高效、灵敏的定量分析，如测序和突变检测。定量分析，如测序和突变检测。可应用于基因表达研究的分析，如基因功能分析、疾可应用于基因表达研究的分析，如基因功能分析、疾病发生机制探讨、药物筛选研究等。病发生机制探讨、药物筛选研究等。第33页，讲稿共34张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第34页，讲稿共34张，创作于星期日