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1、基因工程技术基因工程技术Jackson,Symons,and Berg(1972)generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer(1973)produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host The Nobel Prize in Chemistry 1980定义：定义：基因工程（基因工程（gene engineering）重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technique）：是指在各种）：是指
2、在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆克隆”）和）和 表达表达，这种有目的的，这种有目的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为基因工程。程，总称为基因工程。应用：克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产
3、多肽产品。转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等基因工程基本基因工程基本步骤步骤：分、切分、切 目的基因目的基因+载体分子载体分子 转转 导入到合适的受体细胞（转化）导入到合适的受体细胞（转化）接接 构成重组构成重组DNA分子分子筛筛 筛选含有重组分子的克隆筛选含有重组分子的克隆鉴鉴 鉴定重组分子片段鉴定重组分子片段 基因工程流程示意图基因工程流程示意图构建重组分子（连接）构建重组分子（连接）原料原料：目的基因：目的基因：研究对象研究对象载体：载体：目的基因的运载工具目的基因的运载工具工具酶：工具酶：连接酶、限制性内切酶连接酶、限制性内切酶 目的基因片段目的基因片段来源来源：基
4、因组基因组DNA（非编码序列）（非编码序列）PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆构建或从商品化的已有其它克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增）文库扩增）通过通过RT-PCR 方法得到目的基因方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（价钱昂贵）人工合成基因片段（价钱昂贵）目的基因目的基因来源选择来源选择：取决于解决什么问题？取决于解决什么问题？基因功能研究基因功能研究 cDNART-PCR基因表达调控的研究基因表达调控的研究基因组DNAPCRPCR：引入合适的酶切位点，一个引入合适的酶切位点，一个/两个。两个。加保护碱基，加保护
5、碱基，1-3个。个。加上想要的标签，如加上想要的标签，如 Flag,Myc,His,HA。启始及终止密码子。启始及终止密码子。高保真聚合酶：高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest 等。等。片断的回收与纯化片断的回收与纯化载体：载体：载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。种类：按来源分：质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector).按作用分：克隆载体(cloning vector)、表达载体(expression
6、vector)、穿梭载体(shuttle vector)克隆载体克隆载体(cloning vector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（pBR322）。表达载体表达载体(expression vector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pcDNA3）。穿梭载体穿梭载体(shuttIe vector)能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的
7、 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。质粒载体质粒载体具有具有复制起始点复制起始点，这是质粒自我增，这是质粒自我增殖的必要条件。殖的必要条件。具有较小的分子量，较高的拷贝数，具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个是一个松弛型松弛型的质粒。的质粒。具有某种具有某种选择性标记选择性标记以区别转化和以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。素的抗性，为转化子选择提供便利。（Am
8、pr；Tetr）具有若干限制性内切酶具有若干限制性内切酶单一单一识别位识别位点，便于外源基因插入。点，便于外源基因插入。是细菌染色体外能够自我复是细菌染色体外能够自我复制的双链环状制的双链环状 DNA 分子。分子。克隆载体克隆载体:pBR322 特点：特点：分子量小，分子量小，4.3kb，便于操作。，便于操作。有两个抗性基因，便于转化子筛选。有两个抗性基因，便于转化子筛选。有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于四种位于四环素选择标记上，环素选择标记上，4种位于种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗抗性基因上。
9、外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因性基因的完整性，导致抗性基因插入失活插入失活，这种特性可用于区分重组和，这种特性可用于区分重组和非重组分子。非重组分子。松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。止时，它仍能继续复制。TA TA 克隆克隆AATOPO-TA原核原核 His-tag:pQE系列系列(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX系列系列(Pharmacia)表达载体：表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启带有调控基因表达所必
10、需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。pcDNA 3系列系列(Invitrogen)，真核表达载体：真核表达载体：大多是穿梭载体。大多是穿梭载体。pFLAG-CMV系列系列(Sigma)DNADNA分子的体外连接：方法分子的体外连接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接 两种情况：两种情况：（a）目的基因和载体目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 易自身环化。用碱性磷酸酶(能除掉DNA两端的5 磷酸基团）处 理载体，可防止载体自身环化。（b）目的基因和载体用两种产生粘末
11、端的限制酶 切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。碱性磷酸酶处理：碱性磷酸酶处理：平头末端：平头末端：（1）增加连接酶的量）增加连接酶的量（连接酶对平末端（连接酶对平末端DNA的的Km 约高于粘性末端约高于粘性末端DNA100倍倍）（2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内 切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体 连接。如加上一个人工接头内含连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用序列，用 EcoRI酶切，产生酶切，产生EcoRI 粘性末端。粘性末端。Eco REco R
12、Eco R连接策略：pCMV连接浓度：连接浓度：片段与载体连接机率自身环化片段与载体连接机率自身环化 一般计算公式：一般计算公式：粘性末端：粘性末端：载体片段含量（载体片段含量（ng）/载体长度（载体长度（kb）1 DNA片段含量（片段含量（ng）/DNA片段长度（片段长度（kb）3-5 平末端平末端 1：5 10连接反应：连接反应：10ul 体系体系H2O BufferVectorInsertligase14过夜过夜连接反应条件连接反应条件连接酶的活性；连接酶的活性；DNA的纯度；载体与目的基因的比的纯度；载体与目的基因的比例；例；PH值值7.2-7.8适宜；适宜；14(不高于不高于16)过
13、夜过夜连接酶：两种连接酶：两种DNADNA连接酶：连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。需要一条DNA链的3-末端具有游离的OH，另一条DNA链5-末端的磷酸基团-P，吸能反应，需ATP存在。也可做DNA修复。但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链DNA分子。而且只能连接粘性末端。T4 DNAT4 DNA连接酶：连接酶：是从感染T4噬菌体的Ecoli中分离得到的一种连接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比DNA连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。其他酶：末端修饰酶其他酶：末端修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（te
14、rminal deoxynucleotidyl transferaseterminal deoxynucleotidyl transferase）简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。碱性磷酸酶碱性磷酸酶 根据DNA重组的需要，为防止两DNA片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5-P成为5-OH。目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10
15、倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。重组子导入受体细胞：重组子导入受体细胞：把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的转化或转染的方法。受体细胞的要求：必须具备使外源DNA进行复制的能力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。重组子导入受体细胞：途径重组子导入受体细胞：途径转化：转化：质粒质粒DNADNA或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）的过程的过程转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动转染
16、：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程。被导入细胞的过程。感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。转化转化受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。转化效率：转化效率：只有很少比例的细胞有能力掺入质粒只有很少比例的细胞有能力掺入质粒DNA 转化时大约在转化时大约在1000个个DNA分子中，只有一个分子中，只有一个DNA分子
17、获得成功。分子获得成功。一般每微克完整的一般每微克完整的pBR322DNA产生产生105-107 转化细胞转化细胞 感受态菌制备感受态菌制备感受态：细菌细胞处于一个容易吸收外源DNA状态，这种状态的细菌称为感受态菌。氯化钙法氯化钙法：氯化镁法：氯化镁法：电转法：电转法：氯化钙氯化钙法：原理快速生长的细菌用低渗低浓(50 100mM)的氯化钙（CaCl2)处理，使细胞肿胀成球形加入质粒后，即于细胞表面形成抗DNAase的羟基-磷酸钙复合物经42热休克后，复合物被细胞吸收。非选择性培养基上生长数小时，球状细胞复原开始增殖,抗生素基因表达。重组子的筛选：重组子的筛选：根据重组体根据重组体 的表型筛选
18、的表型筛选抗性基因抗性基因插入失活插入失活：生存或是毁灭？：生存或是毁灭？互补现象：蓝白斑筛选互补现象：蓝白斑筛选LacZ-受体菌编码受体菌编码半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）片断端）片断载体编码载体编码一半乳糖一半乳糖苷酶氨基端（苷酶氨基端（N端）的端）的肽肽分解X-gal，蓝色克隆不分解X-gal白色克隆插入失活：插入失活：互补现象：互补现象：蓝白斑筛选蓝白斑筛选4290s,+900ulLB,37 45min3*1ml菌液菌液沉淀沉淀+0.5mlCaCl26000rpm 5min冰浴冰浴30min6000rpm 5min沉淀沉淀+0.1mlCaCl2+10 ul 连接产物连接产物
19、+10 ulPBR322阴性对照阴性对照A+TA+T阳性对照阳性对照AmpTet冰浴冰浴30min阳性克隆的鉴定：阳性克隆的鉴定：挑菌落，小抽质粒，电泳挑菌落，小抽质粒，电泳菌落菌落PCRPCR94 10 min94 30s55 40s72 1min72 8min 4 holdX 30碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法原理：原理：pH值介于值介于12.0-12.5范围内，线形的范围内，线形的DNA和环状的质粒和环状的质粒DNA变性，中间的氢键短裂，线状变性，中间的氢键短裂，线状DNA变性后互相分开，而环状变性后互相分开，而环状分子双螺旋主链骨架彼此盘绕，互补两条链紧密合在一起。变性分子双螺旋主链
20、骨架彼此盘绕，互补两条链紧密合在一起。变性处理的质粒处理的质粒DNA和染色体和染色体DNA通过致冷或恢复中性通过致冷或恢复中性pH，开始复，开始复性。环状分子由于本身合在一起，所以复性迅速而准确。线状性。环状分子由于本身合在一起，所以复性迅速而准确。线状DNA变性时彼此分开，复性慢而不准确，互相之间聚集形成较大变性时彼此分开，复性慢而不准确，互相之间聚集形成较大的网状结构，离心后，与变性蛋白质和的网状结构，离心后，与变性蛋白质和RNA一道沉淀下来，上清一道沉淀下来，上清液中留存下的主要是环状液中留存下的主要是环状DNA分子和少量的可溶性蛋白质和部分分子和少量的可溶性蛋白质和部分的的RNA，这些
21、可溶性蛋白质和部分的，这些可溶性蛋白质和部分的RNA可可 通过苯酚抽提及通过苯酚抽提及RNA酶处理去除。酶处理去除。试剂作用：试剂作用：溶液溶液I-葡萄糖、葡萄糖、Tris.HCL、EDTA。低渗，细胞。低渗，细胞变的脆弱而易于裂解，变的脆弱而易于裂解，EDTA螯和金属离子，防螯和金属离子，防止止DNA降解。降解。溶液溶液II-NaOH、SDS。NaOH使细胞裂解，释使细胞裂解，释放出质粒放出质粒DNA和染色体和染色体DNA。溶液溶液III-醋酸钾。降低反应醋酸钾。降低反应pH值，起中和作用。值，起中和作用。Protocol:1ml菌液菌液沉淀沉淀+S1 250ul12000rpm 1min彻
22、底重悬彻底重悬+S2 250ul+S3 350ul上清转移至回收柱上清转移至回收柱+500ul W112000rpm 10min轻柔颠倒轻柔颠倒4-6次次5min内内颠倒混匀颠倒混匀12000rpm 1min弃去废液弃去废液12000rpm 1min弃去废液弃去废液+700ul W2+700ul W212000rpm 1min弃去废液弃去废液12000rpm 1min12000rpm 1min弃去废液弃去废液弃去废液，弃去废液，柱转移至收集管柱转移至收集管+50ulTE 12000rpm 1min室温静止室温静止1min质粒样品质粒样品初步鉴定:酶切体系：pBR322 pBR322+弓形虫 ddH2O:7ul 7ul 10*bf:2ul 2ul BSA:2ul 2ul BamH I:1ul 1ul DNA:8ul 8ul37 1.5hr 1%agarose 后续：测序确定插入序列与基因bank报告完全一致检测外源基因有无整合宿主细胞？检测外源基因转录水平表达？检测外源基因蛋白水平表达？