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1、 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 1 食品中 6 种甜味剂同时检测方法的研究 摘 要 甜味剂是食品添加剂中一类重要的产品 ,在世界范围内其应用量在各类食 品添加剂中一直排在前列 ,按营养性价值甜味剂分为非营养高倍甜味剂和营养 性甜味剂 ,被国际食品法典委员会 (CAC)确认的高倍甜味剂有糖精钠、甜蜜素、 AK 糖 (安赛蜜 ) 、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、甜菊苷等。 随着经济的发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品已经不再仅仅要求 温饱、美味， “ 吃的放心 ” 越来越成为人们简单却倍受困扰的愿望。近几年高倍 甜味剂在我国生产上已被越来越多的应用。因为高倍甜味剂的甜度是蔗
2、糖的几十 倍或是几百倍，而使用成本远远低于蔗糖，所以食品生产者不顾消费者的健康和 生命安全超范围、超量使用甜味剂等问题也确实存在，而且为了改善口感 , 提 高甜味剂的甜味稳定性 ,大多数甜味剂由多种成分复合使用。 事实上 ,我国卫生部 2011 年发布的食品添加剂使用标准 GB 2760 - 2011 中对人工甜味剂的加入量有严格规定。但是由于检测方法存在国家标准、行业标 准、地方标准和部分的国外标准等不统一性，使甜味剂的检测方法极度的不统一， 前处理和检测条件要求水品参差不齐，目标物的最低检出限量更是高低不一，有 的相差几倍甚至上百倍。因为当今法规标准的这些缺陷，使食品生产监管部门在 监督管
3、理和执法上存在了很大的困难，有法难依。而且已有的检测标准大都是单 一的甜味剂检测方法，对于复合使用的甜味剂检测，使用已有的检测方法不能同 时检出多种目标物，要进行多次检测，存在前处理重复性，检测过程重复性，检 测周期长，检测不全面，检测成本高，检测效率低等问题，所以为了保证食品质 量安全 , 防止甜味剂的滥用，给监督监管提供执法依据，现在迫切需要建立一 种能够 同时测定食品中多种甜味剂的方法。 已有的文献甜味剂的检测主要集中在糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜等 项目上，或是甜味剂与山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸等防腐剂同时检测，有的是以 上几种甜味剂、防腐剂与诱惑红、赤藓红、日落黄等色素同时检测，通
4、过广泛查 阅国内外资料，发现，食品中甜味剂的研究在国外很早就是一个研究热点；我国 对甜味剂的研究也做了大量工作，有个别的常见的高倍甜味剂例如阿斯巴甜、纽 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 2 甜、阿力甜等的检测方法较成熟，并且已经制定了许多有关甜味剂的标准。这些 甜味剂的检测方法大都采用高效液相色谱法，但是由于这些甜味剂的结构不同， 大多采用不同的检测器，所以以上所涉及的甜味剂没有一个稳定有效的分析方法 可以同时将其检出。 本研究建立了食品中多种甜味剂同时测定的高效液相色谱 -质谱联用检测方 法。主要是通过对食品中的饮料类、果酒类、糕点类、腌菜类基质进行实验研究， 通过沉淀剂的添加，
5、 SPE 柱的选择等方法，建立适合各种基质的目标化合物的提 取和净化技术，进而富集目标化合物和去除杂质，同时消除食品中复杂基质的干 扰，建立了对目标物质进行分离的液相色谱及质谱仪器条件，使大多数目标化合 物都能达到良好的色谱 /质谱响应和分离。对目标化合物在确定的最佳仪器条件 下进行浓度与峰面积的线性关系测定，得到六种甜味剂在 0.01-0.5mg/L，三氯蔗 糖在 1.0-4.0mg/L 范围内浓度与峰面积呈 现良好的线性关系 ，相关系数 在 0.98919-0.99965 之间。 通过对不同基质进行标准添加回收，以 3 倍的信噪比确定方法的最低检测限， 最低检测限在 2.42-3.95 g
6、/L,三氯蔗糖在 6.67mg/L。对不同基质进行方法确证， 确保方法的科学性和适用性，不同基质样品回收率在 78.67%-102.23%范围内，确 定了方法的适用性，从而对食品中的甜味剂建立了一套系统性和完整性的检测方 法。对本实验建立的方法分别进行了三水平方 法验证实验，平均相对标准偏差在 2.21%-4.98%之间，结果表明：方法的重复性和再现性良好。 关键词： 甜味剂 高效液相色谱质谱法 检测 高效液相色谱 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 3 The Simultaneous detection Method Of 6 Types of Sweeteners In Food
7、 Abstract The sweetener is one of the important class of products in food additives. In the world, the mount of its application has been the top row in various types of food additives. According to nutritional value, the sweetener is divided into non-nutritive high-intensity sweeteners and nutritive
8、 sweeteners. The international Codex Alimentarius Commission (CAC) confirm the high-intensity sweeteners are Saccharin、 Cyclamate, Acesulfame, Aspartame, Sucralose, Alitame, Neotame, Stevioside, etc. With economic development, continuous improvement of living standards, the food is no longer require
9、d only food and clothing. Delicious, at ease to eat more and more become a simple but highly troubled people s desire. In recent years, sweeteners in China has been more and more applied. The sweetness of sweeteners is a few times or hundreds of times to sucrose, but the use cost is far lower than s
10、ucrose, so the sweeteners used beyond the scope of the excessive do exist by the food producers, that regardless of consumers health and safety. And in order to improve the taste and the stability of the sweetener sweet, a variety of sweeteners has been combined use. In fact, the use of artificial s
11、weeteners has been strict required by the use of food additives standard GB 2760 2011”, which is released by Chinas Ministry of Health in 2011. However, national standards, industry standards, local standards, and some foreign standards make the detection methods not unity., Pre-treatment and testin
12、g conditions , target minimum detection limit are different, and some difference is between times or even a hundred times. Because of these shortcomings of the current regulations and standards, there are a lot of difficulties in the supervision and management and law enforcement by supervision depa
13、rtment for food production, it is difficult to according law. Existing testing standards are the single sweetener detection method, The compound used of sweetener can not be detected by the existing detection methods at the same time, it should be tested many times. Pre-treatment repeatability, test
14、ing long cycle, testing not comprehensive, high cost of detection and low detection efficiency are exist. Therefore, in order to ensure food quality and safety, to prevent abuse of the sweetener, to providing enforcement supervision and regulatory basis, a determination of multiple sweeteners at the
15、 same time is now urgently need to establish. Researcher or scientist has focused on the detection of sweeteners Saccharin, Cyclamate, Acesulfame, Aspartame and other projects, or sweeteners and Sorbic Acid, Benzoic Acid, Dehydroacetic Acid and other preservatives simultaneous detection, Some of the
16、se types of sweeteners, preservatives and the temptation to red, erythrosine, sunset yellow and other colors simultaneously detect, through a wide access to domestic and international data, it is found that the sweetener in food research is a hot spot early abroad . A lot of work on the sweeteners h
17、as been done in China, some of the common high-intensity sweeteners such as aspartame, Neotame, Alitame detection methods are mature and have developed a number of the sweetener the standards. Most of these sweeteners detection method use high performance liquid chromatography, but due to the differ
18、ent structure of these sweeteners, different detectors has been used. So there is not a stable and efficient analytical methods can detect more than one sweetener 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 4 involved. This study established 6 types of Sweeteners in food in the simultaneous determination of high-performa
19、nce liquid chromatography - mass spectrometry detection. Mainly through the food in the beverage, wine classes, pastry classes, pickles class matrix. By the addition of the precipitant, the SPE column selection and so on, optimize extraction and purification technology of the target compounds for a
20、variety of matrix, and thus enrich target compounds and remove impurities, and eliminate interference of the complex food matrix at the same time. The target substance liquid chromatography separation and mass spectrometer conditions were optimized device selection, the majority of target compounds
21、can achieve a good LC/MS response and separation. Determination of the linear relationship between concentration and peak area of the target compounds were carried out to determine the best instrument conditions, The 6 kinds of sweeteners showed a good linear relationship in the 0.1-0.5mg/L, and suc
22、ralose in the range of 1.0-0.5mg/L, the correlation coefficient between 0.98919-0.99965. Adding recycle standards of different matrix, determine the minimum detection limit of the method, the signal to noise ratio of 3 times the minimum detection limit of 2.42-3.95g/L sucralose 6.67mg/L. Conclusive
23、evidence of the different matrix method to ensure that the science and applicability of the method, different matrices recoveries were in the range of 78.67% -102.23%, and determine the applicability of the method, which set up a system on the sweetener in the food and integrity of the detection met
24、hod. The established three levels of method validation experiments and the average relative standard deviation between 2.21% -4.98% showed that: repeatability and reproducibility of the method are good. Keywords : Sweetener HPLC -ELS- MS Detection HPLC 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 5 目 录 1 引言 . 1 1.1 立论依据 .
25、 1 1.2 文献综述 . 2 1.2.1 甜味剂检测方法 . 2 1.2.2 样品前处理方法 . 8 1.2.3 液相色谱及液相色谱 -质谱联用在食品甜味剂检测 . 10 1.3 本研究的目的与意义 . 12 2 食品中多种甜味剂的检测方法研究 . 12 2.1 实验部分 . 13 2.1.1 仪器、试剂与材料 . 13 2.1.2 色谱条件 . 13 2.1.3 样品溶液的制备 . 14 2.2 结果与讨论 . 15 2.2.1 色谱条件的选择 . 15 2.2.2 色谱柱的选择 . 24 2.2.3 流动相的选择 . 26 2.2.4 流动相流速的选择 . 28 2.2.5 柱温的选择
26、. 29 2.2.6 样品前处理条件的选择 . 31 2.2.7 样品中甜味剂含量分析 . 40 3 结论 . 45 4 创新性 . 46 5.工作展望 . 46 参考文献 . 47 致谢 .54 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 1 1 引言 1.1 立论依据 甜味剂 是最重要的食品添加剂之一 ，在世界范围内其应用量 一直位居各 类食品添加剂的前列 ，按其营养价值甜味剂分为 非营养高倍甜味剂和营养性 甜味剂 ，目前已经有糖精钠 、甜蜜素 、 AK 糖 (安赛蜜 ) 、阿斯巴甜、三氯 蔗糖、纽甜等 几十种甜味剂被国际食品法典委员会 (CAC)确认。 近几年我国的高倍甜味剂得到了迅速发
27、展，在国内甜味剂 在食品生产中的 应用也稳步提高 。但是有个别食品加工生产者超范围、超量、超比例混合使用 甜味剂等问题也是时有发生。 我国卫生部 2011 年发布的食品添加剂使用标准 GB 2760 - 2011 中对 人工甜味剂的加入量有严格规定（见表 1）。但是由于检测方法存在国家标准、 行业标准、地方标准和部分的国外标准等不统一性，使甜味剂的检测方法极度 的不统一，前处理和检测条件要求水品参差不齐，目标物的最低检出限量更是 高低不一，有的相差几倍甚至上百倍。由于当今法规标准的这些缺陷，使食品 生产监管部门在监督管理和执法上存在了很大的困难，有法难依。我国国内目 前除了部分符合质量体系认证
28、的大中型食品企业以外，还存在大量小作坊式食 品加工企业，他们的产品往往直接进入百姓的餐桌，影响人们的健康，所以对 于他们的产品监控形式更为严峻，对这些产品的监控力度尤其要加大，这就要 加大抽样检测量。加大抽样检测量是食品质量监控的重要手段之一，而已有的 检测标准大都是单一的甜味剂检测方法，对于复合使用的甜味剂检测，使用已 有的检测方法不能同时检出多种目标物，要进行多次检测，存在前处理重复性， 检测过程重复性，检测周期长，检测不全面，检测成本高，检测效率低等问题。 而目前国内的监控食品存在数量巨大，成分特别复杂，流通快速，保存时间短 等特点，这就对食品的检测提出了更高的要求，检测要快速、全面、便
29、捷、高 效。 所以为了保证食品质量安全 , 防止甜味剂的滥用，给监督监管提供执法依 据，现在迫切需要建立一种能够同时测定食品中多种甜味剂的方法。 目前，各国对甜味剂的使用都有严格的限量规定，并且有些甜味剂在某些 国家已禁止使用，如日本未批准甜蜜素在食品中的添加，并以此作为一种技术 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 2 壁垒手段，要求食品中不得检出 3。因此，为有效的应对和打击国外技术壁垒 的限制，建立同时检测食品中多种甜味剂含量的分析方法是十分迫切的。同时， 该研究成果能为相关管理部门及食品加工生产企业的质量控制提供技术支撑， 对我国进出口贸易的顺利进行具有重要的意义。 表 1 GB
30、 2760-2011 中规定的甜味剂使用标准 种类 最大使用量范围（ g/kg） 食品名称 糖精钠 0.15-5.0 饮料、面包糕点 /水果干、话梅蜜 饯等 安赛蜜 0.3-4.0 果酱、蜜饯、腌菜等 /胶基糖果、 熟制坚果与籽类等 甜蜜素 0.65-1.2 罐头、糕点等 /脱壳熟制坚果与籽 类等 三氯蔗糖 0.15-1.5 水果干类 /蜜饯凉果等 纽甜 可在各类食品中按生产需要适量使 用 * 阿斯巴甜 可在各类食品中按生产需要适量使 用 * 1.2 文献综述 1.2.1 甜味剂检测方法 目前，常用的甜味剂大多已经建立了国家标准或行业标准。因为各种甜味 剂本身的结构特点和化学、物理特征的不同，
31、甜味剂应用的检测方法和检测仪 器也存在差异。 常用的 6 中高倍甜味剂结构图如表 2。 表 2 6 种甜味剂的中英文名称、 CAS、结构式 编 号 中文名称 英文名称 分子式 Cas 结构式 1 糖精钠 Saccharin Sodium（ SA） C7H4O3NSNa 128-44-9 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 3 2 甜蜜素 Sodium cyclamate （ SC） C6H11NHSO3Na 139-05-9 3 安赛蜜 Acesulfame Potassium （ AK） C4H4KNO4S 33665-90-6 4 阿斯巴甜 Aspartame （ ASP） C14
32、H18N2O5 22839-47-0 5 纽甜 Neotame （ NE） C20H30N2O5 165450-17-9 6 三氯蔗糖 Sucralose （ SU） C12H19Cl3O8 56038-13-2 由此表可以看出，这常用的 6 种甜味剂大多是杂环或是长链的化合物，存 在共轭体系和发色基团，所以可以用液相方法分离或是检测。 常用的 6 种甜味剂的用途及检测方法和使用限量情况如下： （ 1） 糖精钠（ Saccharin SA） 糖精钠，化学名邻苯甲酰磺酰亚胺钠，是传统的甜味剂，应用已有百年历 史，其甜度是蔗糖的 300 倍，因为糖精钠在加工过程中易 产生邻甲苯磺酰胺这 种致癌物质
33、 ，所以许多国家对其安全性一直保持怀疑 ，并禁止其在食品中的 应用 。我国也对糖精钠的使用也有严格的控制 ，并明令禁止在婴儿食品中使 用糖精钠。最大使用量蜜饯凉果、凉果类、话化类 (甘草制品 ) 、果丹 (饼 )类不 高于 5g/kg，饮料、面包、糕点等不高于 0.15g/kg。检测方法有 GB/T 5009.28-2003 食品中糖精钠的测定，此方法有高效液相色谱法、薄层色谱法和离子选择电极 测定法共 3 种，但是薄层色谱法不方便定量，离子选择电极法受苯甲酸、水杨 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 4 酸和对羟基苯甲酸酯类的干扰较大，不太适合目前大量、快速，准确的检测要 求，所以目
34、前大多采用液相色谱法 2。 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸 和糖精钠的测定 高效液相色谱法，这两种方法均采用高效液相色谱法，应用紫 外检测器，检测波长 253.7nm 或是 230nm4-6，对单一物质糖精钠的检测效果良 好，方法检出限为 3mg/kg。 （ 2） 甜蜜素（ Cyclamate SC） 甜蜜素，化学名环己基氨基磺酸钠，它的甜度是蔗糖的 30-80 倍，因对其 致癌性一直存在争议 ，不同的国家对其限定程度 也存在差异 。 甜蜜素在美 国、英国 和日本等国家被禁用，但甜蜜素 是我国食品行业应用最多的一种甜 味剂。检测方法有 GB/T 5009.97-2003
35、食品中环己基氨基磺酸钠的测定。此方 法有气相色谱法、比色法和薄层层析法三种，但是这三种方法适用的检测对象 不同。比色法和气相色谱法，应用氢火焰离子化检测器适用于饮料、凉果等， 薄层层析法适用于果汁、饮料、糕点等，检出限为 4mg/kg8。 SN/T 1948-2007 进出口食品中环己基氨基磺酸钠的检测方法 液相色谱 -质谱 /质谱法，这个方法 一个为高效液相色谱质谱联用法，适用于食品，检出限为 0.1mg/kg 7,9。 （ 3） 安赛蜜（ Acesulfame AK） 安赛蜜，化学名乙酰磺氨酸钾，它的甜 度是蔗糖的 200 倍，安赛蜜主要用 作饮料、冰淇凌、糕点、蜜饯及餐桌用甜料。检测方法
36、为 GB/T 5009.140-2003 饮料中乙酰磺胺酸钾的测定，主要适用于汽水、碳酸饮料、果汁、果茶等，应 用液相色谱法，应用紫外检测器，检测波长 214nm，检出限为 4 g/mL10-11。 （ 4） 阿斯巴甜（ Aspartame ASP） 阿斯巴甜，化学名天门冬酰苯丙氨酸甲酯，俗称蛋白糖，是新型高效甜味 剂，甜度是蔗糖的 200 倍，阿斯巴甜对酸碱的稳定性较差，常用于乳制品、糖 果、 腌渍食品 及饮料类 等。检测方法 GB/T 22254-2008 食品中阿斯巴甜的测 定，适用于碳酸饮料、乳饮料、浓缩果汁和固体饮料中阿斯巴甜的测定，液相 色谱法，应用紫外检测器，检测波长 208nm
37、，方法的检出限为 0.002g/kg，定量 限为 0.006g/kg12-13。 (5) 三氯蔗糖（ Sucralose SU） 三氯蔗糖 ，化学名 4， 1， 6， -三氯 -4， 1， 6， -三脱氧半乳型蔗糖 , 中文 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 5 别名 :蔗糖素；蔗糖晶；三氯半乳糖等 ,其甜度是蔗糖的 600 倍，广泛应用于饮料 类、 乳制品、 调制 酒类、儿童食品 、烘焙食品等食物中。检测方法 GB/T 22255-2008 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定，液相色谱法，应用蒸发光散射 检测器，但前处理较繁琐，需要沉淀分离蛋白，萃取去脂肪，水浴蒸馏等，要 消耗甲醇、正
38、己烷等有机试剂，前处理周期长，因为应用有机试剂对实验者毒 性加大，经济性较差 14-15。 （ 6）纽甜（ Neotame NE） 纽甜，化学名 N-N-(3,3-二甲基丁基 )-L- 天门冬氨酰 -L-苯丙氨酸 1-甲酯 , 是一类新型的二肽类甜味剂，其甜度是蔗糖的 8 000-12 000 倍，检测方法 GB/T 23378-2009 食品中纽甜的测定方法 高效液相色谱法，应用紫外检测器，检测 波长 218nm,定量限为 0.2mg/kg16-17。 我国现有的有关甜味剂的国家标准和行业标准的情况如下： GB/T 5009.28-2003 食品中糖精钠的测定 GB/T 5009.97-20
39、03 食品中环己基氨基磺酸钠的测定 SN/T 1948-2007 进出口食品中环己基氨基磺酸钠的检测方法 液相色谱 -质 谱/质谱法 GB/T 22254-2008 食品中阿斯巴甜的测定 GB/T 22255-2008 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定 GB/T 23378-2009 食品中纽甜的测定方法 高效液相色谱法 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法 GB/T 23746-2009 饲料级糖精钠 QB2393-1998_食品添加剂乙酰磺胺酸钾 SN/T 1371-2004 进出口阿斯巴甜检验规程 GB/T 5009.140-2003 饮料中乙
40、酰磺胺酸钾的测定 6 种甜味剂检测方法及检出限见表 3 食品中 6 种甜味剂同 时 检测方法的研究 6 表 3 6 种甜味剂检测方法及检出限 检测方法 种类 检测波 方法名称 检测设备 长（ nm） 实际检出 限（ mg/kg） 糖精钠 GB/T 5009.28-2003 食品中糖精 钠的测定 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱仪 （ HPLC-VWD/DAD)、薄层色谱法 和离子选择电极测定法 高效液相色谱仪 （ HPLC-VWD/DAD) 230 5.0 253.7 3.0 安赛蜜 GB/T 5009.140-2003 饮料中乙酰 磺胺酸钾的测定 高效液相色谱仪 （ HPLC-VWD/DAD) 214 4.0 甜蜜素 GB/T 5009.97-2003 食品中环己 基氨基