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1、现在学习的是第1页，共96页传统技术：传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、酶联免疫吸附技术、酶联免疫吸附测定（测定（ELISA）新技术：新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作用术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术用于功能蛋白质筛选的表面展示技术 现在学习的是第2页，共96页第一节第一节 蛋白质分析鉴定
2、技术蛋白质分析鉴定技术 一、一、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）技术是为满技术是为满足人们对蛋白质的足人们对蛋白质的高通量、大信息量、高通量、大信息量、平行平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的分析研究而产生的。蛋白质芯片的产生将产生将基因组学平台基因组学平台和和蛋白质组学平台蛋白质组学平台很好地连接起来。很好地连接起来。现在学习的是第3页，共96页 1 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片的概念 蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）也叫也叫蛋白质蛋白质微阵列（微阵列（protein microarray)，是将大量是将大量蛋白质有规则地固定到某
3、种介质载体上蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子白质与其他小分子之间的相互作用检测之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片分析蛋白质的一种芯片（如图（如图）。）。图图 典型的蛋白质微阵列芯片典型的蛋白质微阵列芯片现在学习的是第4页，共96页2 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类 根据用途的不同蛋白质芯片可分：根据用途的不同蛋白质芯片可分：蛋白检测芯片蛋白检测芯片蛋白功能芯片蛋白功能芯片现在学习的是第5页，共96页 蛋白检测芯片蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片的
4、蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检段抗体、受体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。、目标多肽和蛋白等。现在学习的是第6页，共96页 蛋白功能芯片蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行蛋白蛋白-蛋白、蛋白蛋白、蛋白-多肽、蛋白多肽、蛋白-小分子、蛋白小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白结合以及蛋白-酶反应的研究。
5、酶反应的研究。现在学习的是第7页，共96页 3 蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备 固相载体的选择和处理蛋白质靶标的处理将蛋白质靶标点在固相载体上蛋白质芯片的封闭现在学习的是第8页，共96页现在学习的是第9页，共96页Cavin M等制作出高密度蛋白质微阵列等制作出高密度蛋白质微阵列 现在学习的是第10页，共96页 4 蛋白质芯片中探针的标记蛋白质芯片中探针的标记 探针类型：探针类型：蛋白质、酶或其它配基蛋白质、酶或其它配基 标记物类型：标记物类型：荧光染料、酶荧光染料、酶，此外还有，此外还有红色红色荧光蛋白（荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白）和绿色荧光蛋白（GFP）现在学习的是第11页，共96
6、页 5 蛋白质蛋白质芯片信号的检测及数据处理芯片信号的检测及数据处理 信号检测：信号检测：激光共聚焦激光共聚焦检测检测、电荷藕合电荷藕合器件（器件（CCD）检测检测 数据处理：应用一定的数据处理：应用一定的计算机软件计算机软件对检对检测中的测中的扫描图扫描图进行处理，形成数据，得进行处理，形成数据，得出结论。出结论。现在学习的是第12页，共96页 6蛋白质芯片的特点蛋白质芯片的特点 快速、定量快速、定量分析大量蛋白质；分析大量蛋白质；使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；可进行分析和检测；采用采用光敏染料光敏染料标记，标记，灵
7、敏度高，准确性好；灵敏度高，准确性好；所需试剂少，所需试剂少，可直接应用血清样本，可直接应用血清样本，便于诊断，便于诊断，实用性强，其实用性强，其不足不足在于在于稳定性及操作复杂稳定性及操作复杂等因素限等因素限制。制。现在学习的是第13页，共96页 7蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用（1）基础研究方面的应用）基础研究方面的应用蛋白质蛋白质DNA相互作用研究相互作用研究:用用生物化学表面芯片生物化学表面芯片（PS20），），以以 DNA 作诱饵，结合特异蛋白质，用作诱饵，结合特异蛋白质，用质谱法质谱法检测，筛查转录因子。检测，筛查转录因子。蛋白质蛋白质-mRNA 相互作用研究相互作用研究:通过通
8、过mRNA 转录与转录与 RNA 结合蛋白质结合蛋白质的内在联系建立了一种高通量的的内在联系建立了一种高通量的方法，用于鉴定在方法，用于鉴定在结构上和功能上结构上和功能上有关的有关的 mRNA 转录。转录。现在学习的是第14页，共96页（2）临床方面的应用）临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在疾病的诊断和疗效判定疾病的诊断和疗效判定，即，即生物学标志物生物学标志物的检测上，蛋的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用于于自身性免疫疾病自身性免疫疾病的诊断的诊断，肿
9、瘤肿瘤的早期诊断等。由于的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在蛋白质芯片是在分子水平分子水平进行进行诊断和预测诊断和预测的，因而它的，因而它提供了一种更准确的方法。提供了一种更准确的方法。现在学习的是第15页，共96页（3）新药研制方面的应用）新药研制方面的应用 研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片的重中之重。蛋白质芯片高通量、并行性高通量、并行性的特点，大大地的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。加快了化合物的筛选
10、速度。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达蛋白质的表达就可以就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到多大剂确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到多大剂量才会引起毒副作用。量才会引起毒副作用。现在学习的是第16页，共96页（4）环境监测及食品工业中的应用）环境监测及食品工业中的应用 蛋白质芯片还能运用于蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业环境监测及食品工业中，用来检测中，用来检测环境或食品中环境或食品中微量的有毒化学物质或病原菌微量的有毒化学物质或病原菌，如大肠杆，如大肠
11、杆菌。菌。现在学习的是第17页，共96页二、二、蛋白指纹图谱技术蛋白指纹图谱技术 蛋白指纹图谱技术蛋白指纹图谱技术也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（谱（surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），是一种包含），是一种包含层析层析与质谱与质谱的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它结合了结合了芯片微阵列芯片微阵列与与质谱技术质谱技术两者的优点，是继基因芯片之两者的优
12、点，是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。后出现的新一代生物芯片技术。现在学习的是第18页，共96页1 原理原理待分析物（芯片上）不同m/z的离子高能激光质谱图仪器场中飞行电脑处理与基因库中图谱比对发现捕获新蛋白显示蛋白信息现在学习的是第19页，共96页2 组成组成SELDI-TOF-MS蛋白质芯片飞行质谱仪分析软件现在学习的是第20页，共96页3 应用应用 结合结合生物信息学的分析方法生物信息学的分析方法从大量的从大量的蛋白质和多肽蛋白质和多肽中中筛选出潜在的筛选出潜在的生物标记物生物标记物，建立，建立高特异性和敏感性高特异性和敏感性的的蛋白质指纹图谱模型。蛋白质指纹图谱模型。蛋白指纹图
13、谱技术在医学领域的应用，主要用于多蛋白指纹图谱技术在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是种疾病，特别是肿瘤的早期诊断肿瘤的早期诊断。现在学习的是第21页，共96页第二节第二节 研究蛋白相互作用技术研究蛋白相互作用技术 一、一、表面等离子体共振技术表面等离子体共振技术 表面等离子体共振表面等离子体共振技术是一种简单、直接的技术是一种简单、直接的传传感技术感技术，根据这一原理研制的表面等离子体传，根据这一原理研制的表面等离子体传感器在检测、分析生物分子间的相互作用等方感器在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。面得到广泛的应用。现在学习的是第22页，共96页1原理原理表面等离子体
14、共振表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的）是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层，在电磁波的作用下，表面等离子体发生共振现一电荷层，在电磁波的作用下，表面等离子体发生共振现象。象。表面等离子体表面等离子体(SP)的概念，即是指金属表面沿着金属和介的概念，即是指金属表面沿着金属和介质界面传播的电子疏密波。质界面传播的电子疏密波。在金属表面在金属表面,电子横向电子横向(垂直于表面垂直于表面)运动，受到表面的阻挡运动，受到表面的阻挡,因因此在表面上形成了电子浓度的梯度分布，进而引起电子振荡，此在表面上
15、形成了电子浓度的梯度分布，进而引起电子振荡，这种振荡即是电子这种振荡即是电子疏密波疏密波。现在学习的是第23页，共96页 SPR 生物传感器广泛的用于各类生物体系的生物传感器广泛的用于各类生物体系的测定，包括各类测定，包括各类小分子化合物（分子量可小小分子化合物（分子量可小至至100 Da）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至脂分子、病毒和细胞。脂分子、病毒和细胞。SPR 生物传感器不需要借助任何标记即可用生物传感器不需要借助任何标记即可用于分析于分析蛋白质蛋白质-蛋白质、蛋白质蛋白质、蛋白质-小分子、蛋小分子、蛋白质白质-核酸和蛋白质核酸和蛋白质-脂的相互作用。脂的相互
16、作用。现在学习的是第24页，共96页2 SPR 仪结构仪结构 在在 1990 年年 BIAcore 公司首先利用公司首先利用 SPR 原理原理制作了制作了商品化的生物传感器，是商品化的生物传感器，是 SPR 生物传感器的主要生产生物传感器的主要生产厂家。厂家。BIAcore 的的 SPR 生物传感器系统核心部分生物传感器系统核心部分是是传感片、传感片、SPR 光学测定系统和微射流卡盘光学测定系统和微射流卡盘（图（图 为常用为常用 SPR 仪实物图）。仪实物图）。现在学习的是第25页，共96页 传感片传感片是是实时信号实时信号传导的载体，也是该测定系统的传导的载体，也是该测定系统的心脏。芯片是在
17、心脏。芯片是在玻璃片玻璃片上覆盖了一层上覆盖了一层金膜（厚约金膜（厚约 50 nm），），金膜的表面在连接金膜的表面在连接不同的多聚物不同的多聚物以形成不同以形成不同的表面基质用于固定不同性质的生物分子。的表面基质用于固定不同性质的生物分子。微射流卡盘微射流卡盘是一个液体传送系统，通过软件的控制是一个液体传送系统，通过软件的控制自动的传送一定体积的样品至传感片表面。必要的自动的传送一定体积的样品至传感片表面。必要的话，也可以自动的进行样品的回收。话，也可以自动的进行样品的回收。现在学习的是第26页，共96页3 SPR 仪的应用仪的应用 抗体抗体/抗原抗原结合动力学结合动力学 抗原表位抗原表位/
18、抗体对位抗体对位的鉴定的鉴定 临床免疫学中应用临床免疫学中应用 SPR 技术进行技术进行免疫诊免疫诊断断 现在学习的是第27页，共96页二、酵母双杂交技术二、酵母双杂交技术 酵母双杂交技术酵母双杂交技术是一种有效的是一种有效的真核活细真核活细胞胞内研究方法，在内研究方法，在蛋白质相互作用蛋白质相互作用研究研究方面得到了广泛应用并取得了许多有价方面得到了广泛应用并取得了许多有价值的重要发现。值的重要发现。现在学习的是第28页，共96页1 原理原理 1989 年建立年建立了第一个基于了第一个基于酵母的细胞内酵母的细胞内检测蛋白间相检测蛋白间相互作用的遗传互作用的遗传系统，右图显系统，右图显示了酵母
19、双杂示了酵母双杂交系统原理。交系统原理。DNA结合结构域转录转录激活结构域活性转录因子ABC现在学习的是第29页，共96页2 酵母双杂交的组成酵母双杂交的组成 酵母双杂交系统由三个部分组成：酵母双杂交系统由三个部分组成：BD 融合的蛋白表达载体，被其表达的融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称蛋白称诱饵蛋白（诱饵蛋白（bait）；）；AD 融合的蛋白表达载体，被其表达的融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为蛋白称为靶蛋白（靶蛋白（prey）；）；有一个或多个有一个或多个报告基因报告基因的宿主菌株。的宿主菌株。现在学习的是第30页，共96页3 应用应用 酵母双杂交技术主要应用在以下几方面：酵母双杂
20、交技术主要应用在以下几方面：检验检验一对功能已知蛋白一对功能已知蛋白间的相互作用；间的相互作用；研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域；研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域；用用已知功能的蛋白基因已知功能的蛋白基因筛选双杂交筛选双杂交cDNA 文库，以研究文库，以研究蛋白质之间蛋白质之间相互作用的传递途径；相互作用的传递途径；分析新基因的生物学功能。分析新基因的生物学功能。现在学习的是第31页，共96页第三节第三节 表面展示技术表面展示技术 运用运用 DNA 重组技术在重组技术在噬菌体、细菌、真菌噬菌体、细菌、真菌、病毒、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，等微生物表面呈现外源蛋白或多肽
21、，已在已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术技术等方面得到了广泛应用。等方面得到了广泛应用。现在学习的是第32页，共96页概念概念 表面展示技术是利用表面展示技术是利用基因工程基因工程手段将手段将外外源基因源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以以融合蛋白融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。体表面。现在学习的是第33页，共96页一、一、噬菌体展示技术噬菌体展示技术 噬菌体
22、展示技术噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与）是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技并展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。术（如右图所示）。1985 年年 Smith 等首次应用了该等首次应用了该技术。技术。现在学习的是第34页，共96页 1 原理原理 具体来讲噬菌体展示技术就是将具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选待筛选基因基因插入噬菌体插入噬菌体信号肽序列信号肽序列与与主要衣壳主要衣壳蛋白基因（主要是基因蛋白基因（主要是基因或基因或基因）之之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的间，构成融合
23、蛋白噬菌体库。表达的融融合蛋白合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的响噬菌体的完整性和活性。完整性和活性。噬菌体展示载体噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图示意图现在学习的是第35页，共96页利用噬菌体展示技术筛选利用噬菌体展示技术筛选 利用展示的多肽与目标蛋白或肽的亲和结合的性质，可高效率的筛选所需基因。过程如图所示，这样一个吸附-洗涤-洗脱-繁殖的富集过程称为淘洗（panning）。结合洗涤洗脱扩增 噬菌体展示技术筛选原理现在学习的是第36页，共96页噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原
24、则：通量筛选的方法。其建立基于三个原则：I.在在衣壳蛋白基因衣壳蛋白基因（主要是（主要是基因基因或基因或基因）的）的 N 端端插入外源基因，形成的融合蛋白插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋外源蛋白的天然构象白的天然构象，并能被，并能被相应的抗体或受体相应的抗体或受体所识别所识别。现在学习的是第37页，共96页利用固定于利用固定于固相支持物固相支持物的的靶分子靶分子，采用适，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬
25、菌体；，筛选出目的噬菌体；外源多肽或蛋白质外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过可通过分泌型噬菌体分泌型噬菌体的的单链单链DNA测序测序推导推导出来。出来。现在学习的是第38页，共96页 目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有：统有：丝状噬菌体丝状噬菌体展示系统展示系统 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T4 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T7 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 其中，其中，T7 噬菌体噬菌体系统可以系统可以高、中、低高、中、低拷贝展拷贝展示示不同分
26、子量的蛋白不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展，是目前最为理想的展示系统。示系统。现在学习的是第39页，共96页2 应用应用（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程）噬菌体展示技术与蛋白质工程 将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文噬菌体多肽文库库时，该文库可用于时，该文库可用于特异性功能多肽特异性功能多肽的筛选的筛选。同样，利用噬菌体展示。同样，利用噬菌体展示 cDNA 文库文库，可筛，可筛选出特定的选出特定的蛋白质或基因蛋白质或基因。现在学习的是第40页，共96页（2）噬菌体展示技术与抗体工程）噬
27、菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使噬菌体展示技术的出现使抗体工程抗体工程进入进入第三次革命第三次革命。噬菌体展示技术的成功应。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。的抗体。现在学习的是第41页，共96页 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设
28、计适当引物克体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。）。现在学习的是第42页，共96页3 噬菌体展示技术的局限性噬菌体展示技术的局限性 (1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的，这就大大限制了所建库的容量容量和分子的多样性和分子的多样性。(2)不是所有的
29、序列都能在噬菌体中获得很好的表达，不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。现在学习的是第43页，共96页(3)噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。样性。(4)由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素，所以，一
30、些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。分子，很难得到有效表达和展示。现在学习的是第44页，共96页二、二、核糖体展示技术与核糖体展示技术与 mRNA mRNA 展示技术展示技术 核糖体展示（核糖体展示（Ribosome display）技术与）技术与 mRNA 展示技术由于在展示技术由于在体外无细胞翻译体系体外无细胞翻译体系中进行，用中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量（容量和筛选通量（10121014），而且
31、能够增加表达），而且能够增加表达的蛋白质溶解度。的蛋白质溶解度。现在学习的是第45页，共96页核糖体展示技术的基本原理核糖体展示技术的基本原理 核糖体展示技术的基本原理是通过核糖体展示技术的基本原理是通过PCR扩增扩增目的基因的目的基因的 DNA 文库文库，同时加入，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具，并置于具有偶联转录有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，并形成的翻译产物展示在核糖体表面，并形成“mRNA-蛋白质蛋白质-核糖体核糖体”三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，
32、通过三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用体，再利用 RT-PCR 扩增扩增，进行下一循环的，进行下一循环的富集和选择富集和选择，最终筛选出最终筛选出高亲和力的目标分子高亲和力的目标分子（如图所示）。（如图所示）。核糖体展示原理示意图 现在学习的是第46页，共96页核糖体展示的过程核糖体展示的过程 解离 5随机DNA文库体外转录 5体外翻译复合体形成 5筛选 5现在学习的是第47页，共96页mRNA 展示技术的原理展示技术的原理 mRNA 展示技术展示技术也是以也是
33、以 mRNA 和多肽复合体和多肽复合体作为作为筛选的基本单元。其与核糖体展示的区别在于，筛选的基本单元。其与核糖体展示的区别在于，复合体中复合体中 mRNA 与与蛋白质蛋白质通过一个小分子共价连通过一个小分子共价连接，如接，如嘌呤霉素嘌呤霉素（如图所示），且该复合体的产生（如图所示），且该复合体的产生完全在体外，因此很容易构建完全在体外，因此很容易构建大型突变文库大型突变文库（含（含10121013 个独立序列）。个独立序列）。mRNA 展示技术原理示意图展示技术原理示意图 现在学习的是第48页，共96页三、细菌表面展示技术三、细菌表面展示技术 细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞细菌表面展示技
34、术，结合荧光激活细胞筛选仪（筛选仪（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）或流式细胞筛选仪（）或流式细胞筛选仪（flow cytometry）是非常有效的高通量筛）是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。个克隆的功能特性。现在学习的是第49页，共96页原理原理 细菌表面细菌表面有许多能显示有许多能显示保留单一性状保留单一性状在细胞表面在细胞表面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细胞表面酶反通过荧光探针
35、显示出来，荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。现在学习的是第50页，共96页 流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下几个明显的优点：几个明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的
36、克隆进行记录。且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体相比，细菌展示系统在疫苗应用上与噬菌体相比，细菌展示系统在疫苗应用上有许多独特的优势。有许多独特的优势。与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧光激活细胞分选技术（光激活细胞分选技术（FACS）进行更快速更）进行更快速更高效筛选高效筛选。现在学习的是第51页，共96页微生物表面展示文库微生物表面展示文库FACSFACS筛选原理示意图筛选原理示意图 现在学习的是第52页，共96页FACS 具有以下特色具有以下特色：高富集比。高富集比。通常认为通常认为FACS筛选每轮的富集比为筛选每轮的富集比为 103105，
37、而常规的生物淘选每轮的富集比仅为，而常规的生物淘选每轮的富集比仅为 200500；高阳性率。高阳性率。Franscisco 等在等在 1993 年的研究表示，经年的研究表示，经过两轮筛选阳性率过两轮筛选阳性率高达高达 95%以上以上，这是常规生物淘，这是常规生物淘选所无法想像的。选所无法想像的。由于反应在由于反应在溶液状态溶液状态下进行，可克服常规生物淘下进行，可克服常规生物淘选过程中由于筛选配基固定化而导致的选过程中由于筛选配基固定化而导致的“亲和亲和效应效应”。现在学习的是第53页，共96页目前已有的多种细菌表面展示系统目前已有的多种细菌表面展示系统 细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚
38、单位如鞭毛、菌细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛毛 晶核蛋白（晶核蛋白（Icenucleation protein，INP）、自体转运蛋白）、自体转运蛋白（Autotrans-porter）、）、S2 层蛋白层蛋白 枯草杆菌的芽胞外膜，枯草杆菌的芽胞外膜，L2 型大肠杆菌和变形型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜杆菌的细胞膜 现在学习的是第54页，共96页四、酵母表面展示技术四、酵母表面展示技术 酵母表面展示系统酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来是继噬菌体展示技术创立后发展起来的的真核展示系统真核展示系统。酵母的。酵母的蛋白质折叠和分泌机制蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动
39、物与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞颗粒大颗粒大，可用流式细胞仪进行，可用流式细胞仪进行筛选和分离筛选和分离。目前报道的两种。目前报道的两种酵母展示系统分别以酵母展示系统分别以 或或 a 凝集素凝集素作为融合骨架。作为融合骨架。现在学习的是第55页，共96页1 目的蛋白目的蛋白-凝集素表面展示系统凝集素表面展示系统 此系统将此系统将目的蛋白作为目的蛋白作为 N 端端，与，与凝集素凝集素 C 端端部分融合，目的部分融合，目的蛋白经蛋白经凝集素展示于酵母细胞表面。凝集素展示于酵母细胞表面。凝集素凝集素共价连接共
40、价连接到到细细胞壁的葡聚糖胞壁的葡聚糖上，其锚定能力由蛋白质上，其锚定能力由蛋白质 C 端端 320 个氨基酸个氨基酸决定决定，富含，富含 Ser/Thr 残基残基。Ser/Thr 富集富集区因广泛存在的区因广泛存在的O2糖基化糖基化而拥有一个杆状构象，可作为空间支撑物发挥作用。而拥有一个杆状构象，可作为空间支撑物发挥作用。现在学习的是第56页，共96页 迄今，已经有多个应用迄今，已经有多个应用凝集素的凝集素的 C 端作为端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是异源蛋白是-半乳糖苷酶（如图半乳糖苷酶（如图）。）。现在学习的是第57页，共96页
41、2 a凝集素凝集素-目的蛋白表面展示系统目的蛋白表面展示系统 这是一种将这是一种将目的蛋白作为目的蛋白作为 C 端端与与a 凝集凝集素素 Aga2p 亚基的亚基的 N 端端融合的表面展示系融合的表面展示系统。统。a 凝集素通过与凝集素通过与 凝集素相似的连接凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与锚定在细胞壁上。与凝集素不同，凝集素不同，a 凝凝集素由集素由两个亚单位的糖蛋白两个亚单位的糖蛋白组成。组成。现在学习的是第58页，共96页a-凝集素的组成凝集素的组成 a-凝集素由凝集素由核心亚单位（核心亚单位（Aga1p）和和结结合亚单位（合亚单位（Aga2p）两个亚单位组成，两个亚单位组成，Aga1p
42、共共 725 个氨基酸，合成后被个氨基酸，合成后被分泌分泌到胞外到胞外，与酵母细胞壁的，与酵母细胞壁的 葡聚糖葡聚糖共共价连接。价连接。Aga2p 共共 69 个氨基酸，合成后个氨基酸，合成后也被也被分泌到胞外分泌到胞外，但其通过，但其通过 2 个二硫键个二硫键与与 Aga1p 结合，仍与酵母细胞相连。结合，仍与酵母细胞相连。现在学习的是第59页，共96页 Aga2p 的的 N 端端部分参与部分参与二硫键的形成，二硫键的形成，外源蛋外源蛋白白通过与通过与 Aga2p 的的 C 末端末端融合可展示于酵母融合可展示于酵母细胞表面（如图细胞表面（如图）。）。现在学习的是第60页，共96页酵母表面展示
43、技术的应用酵母表面展示技术的应用蛋白质的定向进化：蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋酵母表面展示系统用于蛋白质白质亲和力亲和力和和稳定性稳定性的定向进化已有成功报道的定向进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。，最先被用于抗体的亲和力成熟。活的口服疫苗：活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接在细胞表面表达的蛋白质易于接近近抗体抗体，因此，可被，因此，可被免疫系统免疫系统识别，即使很小识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原性免疫原性。因而可通过在酵母表面表达。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白异质性的抗原蛋白来发展疫苗。来发展疫
44、苗。现在学习的是第61页，共96页第四节第四节 其他新蛋白质工程技术其他新蛋白质工程技术 目前新兴的蛋白质工程技术原子力显微镜技术蛋白质打靶技术蛋白质分子印迹技术蛋白质截短技术蛋白质错误折叠循环扩增技术现在学习的是第62页，共96页一、原子力显微镜技术一、原子力显微镜技术 原子力显微镜（原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）由由 G.Binnig 等于等于 1986 年发明，是扫描探针显微镜家年发明，是扫描探针显微镜家族的主要成员，其族的主要成员，其横向分辨率为横向分辨率为 23 nm，纵向分纵向分辨率为辨率为 0.5 nm。它可以在接近生理环境的。它可以在接近
45、生理环境的大气或液大气或液体体条件下成像，获得直观的三维表面信息，还条件下成像，获得直观的三维表面信息，还可以对原子和分子进行纳米级操纵，因此在生可以对原子和分子进行纳米级操纵，因此在生物结构的研究中具有独特的优势。物结构的研究中具有独特的优势。现在学习的是第63页，共96页原子力显微镜系统结构原子力显微镜系统结构现在学习的是第64页，共96页1 原理原理 AFM 的基本原理是通的基本原理是通过控制并检测样品过控制并检测样品针针尖间的相互作用力尖间的相互作用力来分来分析研究样品的析研究样品的表面性质表面性质的。其工作原理如图所的。其工作原理如图所示。示。现在学习的是第65页，共96页 2 应用
46、应用 采用采用AFM 研究了白蛋白、血红蛋白、胰岛素及分子马研究了白蛋白、血红蛋白、胰岛素及分子马达和噬菌调理素等吸附在不同固体界面上的行为。达和噬菌调理素等吸附在不同固体界面上的行为。用于蛋白单分子结构与功能研究。用于蛋白单分子结构与功能研究。AFM 可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生理活可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生理活动等。如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、抗原抗动等。如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、抗原抗体识别等。体识别等。对一些生理过程，从形态学角度进行了证实对一些生理过程，从形态学角度进行了证实。现在学习的是第66页，共96页 3目前存在的问题目前存在的问题目前，
47、利用目前，利用 AFM 研究的蛋白种类还研究的蛋白种类还很少，能检测到的蛋白性质的参数数很少，能检测到的蛋白性质的参数数量也是十分有限，亟需进一步扩展量也是十分有限，亟需进一步扩展 AFM 在蛋白研究中的应用范围，增在蛋白研究中的应用范围，增强仪器应用的功能性。强仪器应用的功能性。现在学习的是第67页，共96页由于由于 AFM 在机械设计上的限制，单在机械设计上的限制，单分子高分辨拓扑结构的记录时间比大分子高分辨拓扑结构的记录时间比大多数生物过程发生的时间相比长得多多数生物过程发生的时间相比长得多，提高扫描速度是对扫描器的设计工，提高扫描速度是对扫描器的设计工艺乃至材料科学的发展提出了巨大的艺
48、乃至材料科学的发展提出了巨大的挑战挑战 现在学习的是第68页，共96页现有现有 AFM 探针的设计具有明显的物探针的设计具有明显的物理局限性，由于理局限性，由于 AFM 分辨率和功能分辨率和功能与探针性能的密切相关性，因而探针与探针性能的密切相关性，因而探针的改造工艺的提高也是亟待解决的关的改造工艺的提高也是亟待解决的关键问题键问题 现在学习的是第69页，共96页 4解决的途径解决的途径 受材料和制造工艺的水平的限制，将突破点更受材料和制造工艺的水平的限制，将突破点更多地寄托于引入新的设计思想和测量理念，多多地寄托于引入新的设计思想和测量理念，多种高新仪器与技术的联用可能是解决该问题最种高新仪
49、器与技术的联用可能是解决该问题最有希望的方案之一。这些技术包括单分子荧光有希望的方案之一。这些技术包括单分子荧光共振能量转移技术共振能量转移技术、激光光镊技术等。、激光光镊技术等。现在学习的是第70页，共96页二、二、蛋白质打靶技术蛋白质打靶技术 蛋白质打靶蛋白质打靶是最近几年发展起来的一种是最近几年发展起来的一种研究蛋白质功能的新方法。由于其高度研究蛋白质功能的新方法。由于其高度的的特异性特异性和和可控性可控性，正越来越广泛地应，正越来越广泛地应用于用于神经功能神经功能的研究中。的研究中。现在学习的是第71页，共96页原理原理 它采用了一种被称为它采用了一种被称为免疫外源凝集素免疫外源凝集素
50、的的新工具：这是一种通过新工具：这是一种通过 DNA 重组技术重组技术而获得的而获得的 IgG的的Fc 片段片段和和目标受体胞外目标受体胞外域域的的融合蛋白融合蛋白。这使其保持了。这使其保持了天然的与天然的与配体结合的特异性配体结合的特异性和和亲和力亲和力，正是通过，正是通过这种结合而发挥影响受体功能的作用。这种结合而发挥影响受体功能的作用。现在学习的是第72页，共96页免疫外源凝集素具有以下特点：免疫外源凝集素具有以下特点：Fc 区大大增加了其稳定性，并易于用区大大增加了其稳定性，并易于用免疫组化的方法予以定位；免疫组化的方法予以定位；不能通过血脑屏障，但可注入特定脑不能通过血脑屏障，但可注