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1、现代生物学方法论现代生物学方法论吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室核酸技术核酸技术盛永杰盛永杰核酸技术核酸技术-用来研究核酸（用来研究核酸（DNADNA和和RNARNA）的技术）的技术 纯化纯化 定量定量重量上的丰度：光谱定量重量上的丰度：光谱定量 数量上的绝对丰度：定量数量上的绝对丰度：定量PCR PCR 高通量相对丰度：高通量相对丰度：DNADNA芯片芯片 高通量绝对丰度：序列分析基因表达（高通量绝对丰度：序列分析基因表达（SAGESAGE）分子量大小：凝胶电泳分子量大小：凝胶电泳 合成合成从头合成：寡聚核苷酸的合成从头合成：寡聚核苷酸的合成 基因扩增
2、：基因扩增：PCRPCR反应反应 概述概述其他核酸技术其他核酸技术测序测序基因的表达与克隆基因的表达与克隆印记杂交（印记杂交（SouthernSouthern与与NorthernNorthern）生物芯片生物芯片荧光原位杂交荧光原位杂交启动子技术启动子技术 SELEXSELEX技术技术 反义技术反义技术 RNAiRNAi技术技术 非编码非编码RNA RNA 核酸的生物信息学核酸的生物信息学 概述概述一、反义技术一、反义技术反义技术的概念反义技术的概念反义技术的分子机制反义技术的分子机制反义核酸的设计及注意事项反义核酸的设计及注意事项核酶核酶脱氧核酶脱氧核酶1.1 1.1 反义技术概述（反义技术
3、概述（antisense technology)antisense technology)反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因(mRNA)(mRNA)表达的一种生物技术，包括反义表达的一种生物技术，包括反义RNARNA、反义、反义DNADNA、核酶以及脱氧核酶。、核酶以及脱氧核酶。概念概念1.1.2 1.1.2 反义技术的主要应用方向：反义技术的主要应用方向：1 1 通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理、病理条件通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理、病理条件下的生物学功能。下的生物学功能。2 2 研究和开发以疾病相关基因为靶的反义药物研究
4、和开发以疾病相关基因为靶的反义药物反义药物反义药物-利用反义技术研制的药物，以特异的基因为靶，利用反义技术研制的药物，以特异的基因为靶，并与之特异性互补结合的一段约并与之特异性互补结合的一段约2020个核苷酸组成的人工合成个核苷酸组成的人工合成的寡核苷酸。的寡核苷酸。19981998年年FDAFDA批准了第一个反义药物批准了第一个反义药物VitraveneVitravene(巨细胞病毒性视网膜炎）巨细胞病毒性视网膜炎）1.2 1.2 反义技术分子机制的模型反义技术分子机制的模型1 1）仅由结合介导的机制）仅由结合介导的机制反义核酸与特定的序列结合，从而抑制该反义核酸与特定的序列结合，从而抑制该
5、RNARNA与蛋白、与蛋白、其他核酸或其他因子的相互作用，最终影响其他核酸或其他因子的相互作用，最终影响RNARNA的的代谢与功能。代谢与功能。2 2）结合激活不稳定的机制。结合激活不稳定的机制。通过反义结合，影响通过反义结合，影响RNARNA的稳定性、的稳定性、RNARNA加工、亚细胞定位加工、亚细胞定位和转运等。和转运等。3 3）其他机制其他机制1.2.1 1.2.1 机制机制1.2.2 1.2.2 影响反义核酸生物学活性的因素：影响反义核酸生物学活性的因素：反义核酸浓度反义核酸浓度 靶靶RNARNA浓度浓度靶靶RNARNA代谢速率代谢速率抑制机制的类型和效率等抑制机制的类型和效率等1.2
6、.3 1.2.3 反义技术需要注意的问题反义技术需要注意的问题反义核酸的纯度反义核酸的纯度反义核酸的结构反义核酸的结构靶靶RNARNA结构结构反义核酸在组织和细胞内的转运和分布反义核酸在组织和细胞内的转运和分布反义核酸与非核酸因子的结合及其影响反义核酸与非核酸因子的结合及其影响不同抑制机制的作用不同抑制机制的作用能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性：能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性：DNADNA序列的特异性和唯一性序列的特异性和唯一性 导入细胞的高效性导入细胞的高效性 无非特异性结合蛋白无非特异性结合蛋白 反义寡核苷酸反义寡核苷酸mRNAmRNA特异形成杂交体特异形成杂交体 靶蛋白或靶靶蛋白或
7、靶mRNAmRNA水平下降水平下降 反义寡核苷酸无毒性反义寡核苷酸无毒性 反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应1 1 靶目标的选择尽量避免易突变区靶目标的选择尽量避免易突变区一般选择目标为起始密码子（一般选择目标为起始密码子（AUG)AUG)或其附近的或其附近的15-2515-25个碱基序列，以及该靶个碱基序列，以及该靶mRNAmRNA的的55帽区，帽区，33非翻译区非翻译区2 2 长度长度反义核苷酸一般是反义核苷酸一般是15-20bp15-20bp长的单链，但是设计病毒长的单链，但是设计病毒和质粒载体可用较长的或全长和质粒载体可用较长的或全长DNADNA序
8、列。序列。3 3 反义核苷酸的修饰反义核苷酸的修饰4 4 缺陷的避免缺陷的避免避免回文结构以形成二聚体，避免回文结构以形成二聚体，GCGC含量不能太高避免产生高毒性和非特异性，含量不能太高避免产生高毒性和非特异性，GCGC含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体。含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体。1.3 1.3 反义核苷酸设计原则：反义核苷酸设计原则：1.4 1.4 核酶核酶（Ribozyme,catalytic RNA,RNA enzymeRibozyme,catalytic RNA,RNA enzyme、RNAzymeRNAzyme）具有催化活性的具有催化活性的RNARNA分子分子核酶的发现核酶的
9、发现19811981年年 CechCech发现四膜虫前体发现四膜虫前体rRNArRNA可以在没有蛋白质可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。工过程。19831983年年 AltmanAltman在研究在研究RNasePRNaseP时发现，该酶中的时发现，该酶中的RNARNA分子单独完成前体分子单独完成前体tRNAtRNA加工。加工。19891989年年 CechCech与与AltmanAltman共同获得了诺贝尔化学奖共同获得了诺贝尔化学奖剪切型核酶剪切型核酶剪接型核酶剪接型核酶根据催化反应根据催化反应锤头核酶锤头核酶发夹核酶发夹核
10、酶丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV)核酶核酶RNaseP组组II 内含子内含子组组I 内含子内含子1.4.2 1.4.2 核酶的分类核酶的分类自身剪切类核酶：自身剪切类核酶：在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶、在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶、发夹核酶、肝炎发夹核酶、肝炎病毒（病毒（HDV)HDV)核酶、核酶、VSVS核酶、核酶、glmSglmS核酶核酶和和CPEB3CPEB3核酶。核酶。自身剪切类核酶共同特征：自身剪切类核酶共同特征：1 1 分子小，一般为分子小，一般为35-15535-155个核苷酸。个核苷酸。2 2 剪切自身或异体剪切自身或异体RNARNA序列中的保守位点的磷
11、酸二酯键，序列中的保守位点的磷酸二酯键，相当于内切核酸酶，产物带有相当于内切核酸酶，产物带有5-OH5-OH和和22，3-3-环状膦酸酯。环状膦酸酯。3 3 催化机制都是一般酸碱催化，质子的转移是共同的。催化机制都是一般酸碱催化，质子的转移是共同的。4 4 属于金属酶，催化反应都需要二价金属离子。属于金属酶，催化反应都需要二价金属离子。锤头核酶：锤头核酶：小分子自身分裂小分子自身分裂RNARNA，自身分裂是顺式（，自身分裂是顺式（cis)cis)反应，分子间分裂是反式（反应，分子间分裂是反式（trans)trans)反应。反应。箭头指向切割位点箭头指向切割位点最小锤头核酶由三个结构域组成：最小
12、锤头核酶由三个结构域组成：1 1 分裂结构域分裂结构域GUXGUX（X X可以是可以是A A、U U、C C但不可以为但不可以为G G）2 2 催化结构域：其中有催化结构域：其中有1313个核苷酸是保守的个核苷酸是保守的2 2 底物结合结构域底物结合结构域1.1.二价金属阳离子（种类、离子强度）二价金属阳离子（种类、离子强度）2.2.温度温度3.3.pHpH值值 影响影响锤头核酶锤头核酶活性的主要因素活性的主要因素自身剪接类核酶：自身剪接类核酶：I I类内含子、类内含子、IIII类内含子、类类内含子、类-I-I类内含子（类内含子（groupI groupI like-intron)-GIR1l
13、ike-intron)-GIR1分支核酶和剪接体，以及具有分支核酶和剪接体，以及具有33，5-RNA5-RNA连接酶活性的天然核酶连接酶活性的天然核酶I I类内含子的特征：类内含子的特征：长度长度140-4200nt140-4200nt，剪接位点序列为，剪接位点序列为5UG35UG3 催化核心是保守的催化核心是保守的 有内部的引导序列（有内部的引导序列（IGSIGS）通过转酯反应实现自身的剪接，需要辅因子通过转酯反应实现自身的剪接，需要辅因子IIII类内含子特征类内含子特征：最大的核酶之一，长度为最大的核酶之一，长度为400-1000nt400-1000nt。II II 类内含子不富含高度保守
14、的序列（结构域类内含子不富含高度保守的序列（结构域V V和结和结 构域构域IVIV可读框除外），但是采用高度保守的二级结可读框除外），但是采用高度保守的二级结 构，构，6 6个结构域围绕大的中心接合以特定的位置排列。个结构域围绕大的中心接合以特定的位置排列。RNPRNP类核酶类核酶核糖核蛋白酶（核糖核蛋白酶（ribonucleoprotein enzyme,RNPzyme)ribonucleoprotein enzyme,RNPzyme)，由由RNARNA和蛋白质成分组成的酶。和蛋白质成分组成的酶。分类：分类：根据根据RNPRNP酶中酶中RNARNA和蛋白质分子对起结构与功能的贡献和蛋白质分子
15、对起结构与功能的贡献是不同。是不同。1 RNP1 RNP核酶：由一个催化核酶：由一个催化RNARNA和多个蛋白质组成，和多个蛋白质组成，RNase PRNase P、剪接体和核糖体等。、剪接体和核糖体等。2 RNP2 RNP酶：催化作用依赖于蛋白质和酶：催化作用依赖于蛋白质和RNARNA的密切合作，端粒酶。的密切合作，端粒酶。3 RNP3 RNP蛋白质酶：由结构蛋白质酶：由结构RNARNA和蛋白质酶组成，信号识别颗粒和蛋白质酶组成，信号识别颗粒SRPSRP。核酶的应用核酶的应用1.1.核酶在抗核酶在抗HIVHIV中的应用中的应用2.2.核酶抗肝炎病毒的应用核酶抗肝炎病毒的应用 3.3.核酶在抗
16、生殖道感染的应用核酶在抗生殖道感染的应用4.4.核酶在抗白血病中的应用核酶在抗白血病中的应用5.5.核酶在抗移植排斥反应中的应用核酶在抗移植排斥反应中的应用1.5 脱氧核酶脱氧核酶（Deoxyribozyme,catalytic DNA,DNA Deoxyribozyme,catalytic DNA,DNA enzymeenzyme、DNAzymeDNAzyme）单链单链DNADNA和单链和单链RNARNA的区别的区别1 RNA1 RNA中有中有2-OH2-OH，DNADNA则没有则没有2 RNA2 RNA中有尿嘧啶（中有尿嘧啶（U)U)，DNADNA则是则是5-5-甲基尿嘧啶（甲基尿嘧啶（T
17、)T)3 3 糖环的折叠上，糖环的折叠上，RNARNA的优势构象是的优势构象是C C3 3-endo-endo，而，而DNADNA的优势构象是的优势构象是C C2 2-endo-endo。1994年年Breaker R R 与与Joyce G F通过体外筛选得到具有催通过体外筛选得到具有催化活性的化活性的DNABreaker R RBreaker R RJoyce G FJoyce G F与核酶相比，脱氧核酶具有明显的优势：与核酶相比，脱氧核酶具有明显的优势：1 相对分子质量小，合成成本低，稳定性高，选择性强，相对分子质量小，合成成本低，稳定性高，选择性强，不仅可以精确的切割或连接底物不仅可以
18、精确的切割或连接底物RNA/DNA，而且可以，而且可以催化更广泛的化学反应。催化更广泛的化学反应。2 脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，作用程序脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，作用程序和时间容易控制。和时间容易控制。脱氧核酶可以催化反应类型脱氧核酶可以催化反应类型 1.切割切割RNA的脱氧核酶的脱氧核酶2.切割切割DNA的脱氧核酶的脱氧核酶 3.聚核苷酸激酶活性的脱氧核酶聚核苷酸激酶活性的脱氧核酶 4.连接酶活性的脱氧核酶连接酶活性的脱氧核酶5.催化卟啉环金属螯合反应催化卟啉环金属螯合反应的的脱氧核酶脱氧核酶6.N-糖基化激酶活性糖基化激酶活性的脱氧核酶的脱氧核酶常见的几种脱氧核
19、酶常见的几种脱氧核酶1.1.10102323结构脱氧核酶结构脱氧核酶2.2.8 81717结构脱氧核酶结构脱氧核酶3.3.手枪型脱氧核酶手枪型脱氧核酶4.4.二分结构脱氧核酶二分结构脱氧核酶 R=A or GY=C or UsubstrateCleavage site 1023结构脱氧核酶结构脱氧核酶1 在模拟的生理条件（在模拟的生理条件（2mmol/LMgCl2、150mmol/LKCl、pH7.5、37），以多转化率分裂靶），以多转化率分裂靶RNA。2 选择靶位点灵活，能够用任一靶选择靶位点灵活，能够用任一靶RNA形成形成Watson-Crick碱基碱基配对，能够在任一嘌呤和嘧啶之间分裂配
20、对，能够在任一嘌呤和嘧啶之间分裂RNA。影响影响1023脱氧核酶脱氧核酶活性的主要因素活性的主要因素1.1.活性中心核苷酸的组成活性中心核苷酸的组成2.2.二价金属阳离子（种类、离子强度）二价金属阳离子（种类、离子强度）3.3.反义臂长度与核苷酸组成反义臂长度与核苷酸组成4.4.效应物分子的作用效应物分子的作用 817结构脱氧核酶结构脱氧核酶1 原型酶只分裂底物原型酶只分裂底物5-AG-3，A不与脱氧核苷不与脱氧核苷 酸配对酸配对2 靶部位的下游有靶部位的下游有“rG-dT”摆动配对。摆动配对。脱氧核酶的应用脱氧核酶的应用1.1.脱氧核酶在基因治疗中的应用脱氧核酶在基因治疗中的应用a.a.在抗
21、肿瘤方面应用在抗肿瘤方面应用b.b.抗抗HIVHIV病毒方面应用病毒方面应用c.c.其它针对其它针对mRNAmRNA的应用的应用2.2.在在PCRPCR技术上的应用技术上的应用3.3.作为分子生物学分析的工具作为分子生物学分析的工具 根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑RNA柔性比柔性比DNA大，设计大，设计一个以锤头核酶为催化结构域和以一个以锤头核酶为催化结构域和以DNA为骨架的环状为骨架的环状RNA-DNA酶。酶。Hammerhead ribozymeDNA20 mer随机随机DNA体外筛选体外筛选5轮筛选轮筛选5-ACA TGG CTA CCC AAG C
22、AT GA-3cRDEScheme for construction of circular RNA-DNA enzyme环状核酶的构建环状核酶的构建锤头核酶锤头核酶单链单链DNA10-23结构脱氧核酶结构脱氧核酶单链单链DNA载体载体M13mp18 5-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3cRDE环状环状RNA-DNA酶酶可复制可复制 的环状的环状DNAzymeC-DZ482以高活性、结构稳定的以高活性、结构稳定的10-23 DNAzyme为催化中心，以单链载体为催化中心，以单链载体M13mp18为骨架构建了环状可复制的为骨架构建了环状可复制的10-23 DNAzyme。
23、环状脱氧核酶的构建环状脱氧核酶的构建 以以10-23 DNAzyme-hammerhead ribozyme 为催化中心，以单链载体为催化中心，以单链载体pBlue script II KS(+)为骨架构建了复合酶为骨架构建了复合酶DNAzyme-RNAzyme。单链单链DNA载体载体M13mp18 10-23结构脱氧核酶结构脱氧核酶编码锤头核酶编码锤头核酶DNA10-23结构脱氧核酶结构脱氧核酶单链单链DNA载体载体pBluescript II KS(+)Hammerhead ribozyme activityDNAzyme-RNAzyme锤头核酶锤头核酶单链单链DNAcRDE10-23 D
24、NAzyme activityTranscription in vitro“Translation”Replicationpepzyme activityCircular DNAzymes环状脱氧核酶环状脱氧核酶-核酶复合酶的构建核酶复合酶的构建核酶与脱氧核酶的转换核酶与脱氧核酶的转换核酶与脱氧核酶的转换核酶与脱氧核酶的转换conversion双功能脱氧核酶的设计与构建双功能脱氧核酶的设计与构建二二 RNA RNA干涉干涉(RNA interference,RNAi)(RNA interference,RNAi)2.1 RNA 2.1 RNA 干涉现象的发现干涉现象的发现1990 1990 年
25、，为加深矮牵牛花年，为加深矮牵牛花(petunias)(petunias)的紫色，的紫色，Jorgensen Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基因等导入了一个强启动子控制的色素基因.可可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色色甚至白色.这是由于转基因和同源的内源基因的表达这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，都被抑制了，Jorgensen Jorgensen 把这个现象命名为共抑制把这个现象命名为共抑制(cosuppressioncosuppression)。1995 1995 年，康奈尔大学的年，
26、康奈尔大学的Su Su GuoGuo在用反义在用反义RNA(antisenseRNA(antisense RNA)RNA)阻断线虫基因表达的试验中发现，阻断线虫基因表达的试验中发现，反义反义RNA(antisenseRNA(antisense RNA)RNA)和正义和正义RNA(senseRNA(sense RNA)RNA)都阻断了基都阻断了基因的表达。因的表达。1998 1998 年，年，Andrew Fire Andrew Fire 等的研究证明，在正义等的研究证明，在正义RNA RNA 阻断阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNARNA，同时
27、包，同时包含了正义链和反义链的双链含了正义链和反义链的双链RNA(double-stranded RNARNA(double-stranded RNA，dsRNAdsRNA)阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义链强得多。链强得多。1998 1998 年年2 2 月月19 19 日日 自然杂志自然杂志(Nature)(Nature)Fire Fire 与与 Mello Mello 发现发现RNAi RNAi 的实验的实验带有肌肉蛋白编码信息的带有肌肉蛋白编码信息的RNA RNA 被注射到线虫被注射到线虫(C.elegans)(C.elegans
28、)体内体内.单链单链RNA RNA 没有产生任何效果没有产生任何效果.但当双链但当双链RNA RNA 注射之注射之后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷型基因的线虫所表现出的表型。型基因的线虫所表现出的表型。2006 2006 年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖Andrew Z.FireAndrew Z.FireCraig C.MelloCraig C.Mello颁奖声明颁奖声明获得者发现了一种可以针对特定基因降解其获得者发现了一种可以针对特定基因降解其mRNA mRNA 的方式，在这种的方式，在这种RNA RNA 干涉现
29、象中，干涉现象中，双链双链RNA(double-stranded RNA)RNA(double-stranded RNA)以一种非常明确的以一种非常明确的方式抑制了基因表达。植物、动物、人类都存方式抑制了基因表达。植物、动物、人类都存在在RNA RNA 干涉现象，干涉现象，RNA RNA 干涉对于基因表达的调干涉对于基因表达的调控、对病毒感染的防护、控制跳跃基因具有重控、对病毒感染的防护、控制跳跃基因具有重要的意义。要的意义。dsRNAdsRNA的分子调控分类的分子调控分类mRNAmRNA降解降解转录抑制转录抑制翻译抑制翻译抑制染色体重构染色体重构2.2 RNAi2.2 RNAi的分子机制的分
30、子机制RNAiRNAi的分子机制的分子机制RNAiRNAi的分子机制的分子机制2.2.1 dsRNA2.2.1 dsRNA的产生的产生dsRNA dsRNA 来源：来源：细胞内源性基因的双向表达细胞内源性基因的双向表达 具有反向重复结构的细胞内源性基因表达形成的发夹状具有反向重复结构的细胞内源性基因表达形成的发夹状 RNARNA（shRNAshRNA)转基因表达的转基因表达的mRNA mRNA 异常聚合异常聚合 转座子转录转座子转录 RNARNA病毒基因组或病毒感染复制过程中的中间病毒基因组或病毒感染复制过程中的中间RNARNA产物产物 实验方法通过质粒载体或病毒载体转染表达的实验方法通过质粒
31、载体或病毒载体转染表达的dsRNAdsRNA或或shRNAshRNA 2.2.2 2.2.2 起始阶段：起始阶段：dsRNAdsRNA被被Dicer Dicer 酶加工成为酶加工成为 siRNAsiRNADicer Dicer 酶（酶（RnaseIII RnaseIII 核糖核酸酶家族）核糖核酸酶家族）能够在能够在RNAiRNAi中能够有效将中能够有效将dsRNAdsRNA降解为降解为siRNAsiRNA，进而诱导，进而诱导RNAiRNAiDicer Dicer 酶在进化上高度保守酶在进化上高度保守DicerDicer酶以单体形式催化两个核酸内切反应酶以单体形式催化两个核酸内切反应2.2.3
32、2.2.3 中间阶段：中间阶段：RISCRISC装载装载siRNAsiRNA2.2.3.1 RNA2.2.3.1 RNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体RISCRISC，RNA-induced silencing complexRNA-induced silencing complex2.2.3.2 RISC2.2.3.2 RISC的装载与起始阶段偶联的装载与起始阶段偶联2.2.3.3 RISC2.2.3.3 RISC装载单链装载单链siRNAsiRNA如果双链的其中一端不稳定，那么这一段具有如果双链的其中一端不稳定，那么这一段具有55磷酸基团的单链磷酸基团的单链更加倾向于与更加倾向于与RIS
33、CRISC进行装配，那么这条链会引导进行装配，那么这条链会引导RISCRISC寻找与之寻找与之匹配的匹配的mRNAmRNA并进行切割，此条链称为引导链（并进行切割，此条链称为引导链（guide strand)guide strand)，另一条链称为过客链（另一条链称为过客链（passenger strand)passenger strand)，会被遗弃不用。，会被遗弃不用。影响影响siRNAsiRNA链选择的两个因素：链选择的两个因素：siRNAsiRNA热力学稳定性；热力学稳定性；DicerDicer酶剪切方向酶剪切方向2.2.3.4 RISC2.2.3.4 RISC装载对装载对ATPATP
34、的依赖的依赖精简的精简的RISCRISC不需要不需要ATPATP，完整的，完整的RISCRISC需要需要ATPATP2.2.4 2.2.4 完成阶段：完成阶段：RISCRISC剪切剪切mRNAmRNA处于活性状态的处于活性状态的RISCRISC装载有装载有siRNAsiRNA的引导链，接下来的引导链，接下来它将寻找识别与之匹配的它将寻找识别与之匹配的mRNAmRNA，一旦，一旦mRNAmRNA与引导链与引导链之间有着充分的碱基互补配对，之间有着充分的碱基互补配对，RISCRISC将会对将会对mRNAmRNA进进行切割，这一过程与行切割，这一过程与 siRNA siRNA 过客链的剪切过程类似过
35、客链的剪切过程类似剪切位点的选择剪切位点的选择高度特异，通常位于从高度特异，通常位于从siRNA5siRNA5端数起的端数起的1111到到1212个碱基位置个碱基位置2.3 siRNA2.3 siRNA分子靶位点的选择分子靶位点的选择靶基因中靶基因中RNARNA干涉作用位点的选择遵循原则：干涉作用位点的选择遵循原则：1 1）从起始密码子寻找）从起始密码子寻找5-AA5-AA（N19N19）TTTT序列，如果在靶基因中不存在这种序列，序列，如果在靶基因中不存在这种序列，可以寻找可以寻找5-AA(N21)5-AA(N21)或或5-NA5-NA（N21)N21)序列。序列。2 2）如果需要抑制内源性
36、靶基因的表达以后在表达该基因的突变体或含有标）如果需要抑制内源性靶基因的表达以后在表达该基因的突变体或含有标签的融合基因，则靶位点应该选择基因的签的融合基因，则靶位点应该选择基因的55或或33非编区，以便于后续的实验操作非编区，以便于后续的实验操作3 3）避开靶基因的内含子序列，因为）避开靶基因的内含子序列，因为RNAiRNAi主要发生在胞浆内，而未拼接的主要发生在胞浆内，而未拼接的mRNAmRNA主要位于细胞核内主要位于细胞核内4 4）选择）选择GCGC含量比较低的序列作为含量比较低的序列作为 siRNA siRNA。一般来说，。一般来说，G/CG/C含量为含量为40-55%40-55%之间
37、的之间的siRNAsiRNA比比G/CG/C含量大于含量大于55%55%的的siRNAsiRNA更有效，此外富更有效，此外富含含G G序列更容易在细胞中形成高级结构导致非特异性的反应序列更容易在细胞中形成高级结构导致非特异性的反应5 5）设计时最好找寻形成二级结构趋势较小的位点）设计时最好找寻形成二级结构趋势较小的位点6 6）在进行）在进行RNARNA干涉实验室，针对每个靶基因至少要设计并分析干涉实验室，针对每个靶基因至少要设计并分析4 4个个siRNAsiRNA分子并尽可能使这些分子并尽可能使这些siRNAsiRNA位点沿着靶基因分布，一寻找有效位点沿着靶基因分布，一寻找有效的靶位点，提高实
38、验的成功率的靶位点，提高实验的成功率7 7）确定靶位点后，应该通过）确定靶位点后，应该通过BLASTBLAST检索确保选择的检索确保选择的siRNAsiRNA与其它基与其它基因没有明显的同源性因没有明显的同源性2.3 siRNA2.3 siRNA分子靶位点的选择分子靶位点的选择化学合成化学合成siRNAsiRNA 靶靶mRNAmRNA序列：序列：5-aa5-aaguaucgaguucagcauuccguaucgaguucagcauuccuu-3uu-3 siRNA siRNA分子：分子：5-5-guaucgaguucagcauuccguaucgaguucagcauuccuu-3 uu-3 正义
39、链正义链 3-uu 3-uucauagcucaagucguaaggcauagcucaagucguaagg-5 -5 反义链反义链siRNAsiRNA分子的设计分子的设计合成时，可以用合成时，可以用T T代替代替U U降低成本，提高降低成本，提高siRNAsiRNA分子的稳定性。分子的稳定性。体外转录合成体外转录合成siRNAsiRNA成本低，抑制效果明显优于化学合成成本低，抑制效果明显优于化学合成实验室通常采用实验室通常采用T7RNAT7RNA聚合酶体外转录合成聚合酶体外转录合成siRNA siRNA 采用采用RNARNA聚合酶聚合酶IIIIII启动子表达启动子表达 siRNA siRNA分子
40、分子载体表达法载体表达法PCRPCR方法方法采用采用RNAseIIIRNAseIII制备制备siRNAsiRNA分子分子首先在体外以长为首先在体外以长为200-1000bp200-1000bp的的cDNAcDNA为模板转录合成正义与反义为模板转录合成正义与反义 的单链的单链RNARNA分子，分子，然后通过退火形成长的然后通过退火形成长的dsds分子，再用分子，再用DicerDicer核酸酶进行切割得到核酸酶进行切割得到 siRNAsiRNA分子的混合物，通过纯化取出没有被切割的双链分子的混合物，通过纯化取出没有被切割的双链RNARNA分子分子 和和DNADNA模板，模板，siRNAsiRNA分
41、子可以用于转染细胞。分子可以用于转染细胞。优点：不需要大量的合成并筛选有效的优点：不需要大量的合成并筛选有效的siRNAsiRNA作用位点作用位点缺点：可能会产生非特异性的基因沉默缺点：可能会产生非特异性的基因沉默RNAiRNAi实验注意事项：实验注意事项：1 1 必须采取措施防止和消除必须采取措施防止和消除RNaseRNase的污染。的污染。2 2 在进行在进行RNARNA干涉实验之前，应该考虑到靶基因产物的干涉实验之前，应该考虑到靶基因产物的半衰期及其在细胞中的丰度和表达调控机制。半衰期及其在细胞中的丰度和表达调控机制。RNAiRNAi不不适合研究具有长半衰期的蛋白质在细胞中的功能。适合研
42、究具有长半衰期的蛋白质在细胞中的功能。3 RNAi3 RNAi不适合有些酶基因的功能研究。不适合有些酶基因的功能研究。4 4 用于转染细胞的用于转染细胞的siRNAsiRNA分子的浓度同靶基因的特性分子的浓度同靶基因的特性和细胞类型有关。用于转染细胞的和细胞类型有关。用于转染细胞的siRNAsiRNA分子的浓度分子的浓度一般在一般在30-100nmol/L30-100nmol/L之间。之间。5 5 不同细胞的转染效率是不同的，对于不同的转染试剂不同细胞的转染效率是不同的，对于不同的转染试剂和培养细胞需要通过预实验来确定转染条件。生长状况和培养细胞需要通过预实验来确定转染条件。生长状况良好的细胞
43、转染效率要比生长状况较差的细胞要高。良好的细胞转染效率要比生长状况较差的细胞要高。6 6 尽量采用传代次数较少的，一般采用传代次数在尽量采用传代次数较少的，一般采用传代次数在5050代以内的细胞进行转染。代以内的细胞进行转染。7 7 细胞密度对转染效率的影响，对贴壁细胞来说，最佳转染密细胞密度对转染效率的影响，对贴壁细胞来说，最佳转染密度为度为30-70%30-70%。8 8 用适当的阳性用适当的阳性siRNAsiRNA对照优化转染和检测条件。看家对照优化转染和检测条件。看家基因是较合适的阳性对照。要有基因是较合适的阳性对照。要有1-21-2个阴性对照来确定个阴性对照来确定靶靶siRNAsiR
44、NA对靶基因抑制作用的特异性。对靶基因抑制作用的特异性。9 9 抑制靶基因后，先观察细胞表型的变化，然后通过抑制靶基因后，先观察细胞表型的变化，然后通过免疫印迹与免疫荧光检测细胞内的蛋白质水平的变化。免疫印迹与免疫荧光检测细胞内的蛋白质水平的变化。若没有特异的靶蛋白抗体，可以通过若没有特异的靶蛋白抗体，可以通过NorthernNorthern印迹确定印迹确定mRNAmRNA水平的变化。水平的变化。10 10 体外合成的体外合成的siRNAsiRNA对靶基因的抑制作用是瞬时的，细胞对靶基因的抑制作用是瞬时的，细胞中受到抑制的蛋白一般在转染中受到抑制的蛋白一般在转染5-75-7天后，即经过天后，即
45、经过7-107-10个细胞个细胞增殖周期就可以逐渐恢复至正常水平。增殖周期就可以逐渐恢复至正常水平。11 siRNA11 siRNA不能抑制靶基因表达时，首先要查明所采用的不能抑制靶基因表达时，首先要查明所采用的基因序列和试验用的细胞系是否来源于同一物种，然后基因序列和试验用的细胞系是否来源于同一物种，然后检查所采用的基因序列是否可靠。检查所采用的基因序列是否可靠。启动子技术启动子技术启动子与基因表达调控启动子与基因表达调控启动子的预测技术启动子的预测技术转录活性的测定转录活性的测定非编码非编码RNARNA非编码非编码RNARNA的概念与种类的概念与种类非编码非编码RNARNA的功能的功能非编
46、码非编码RNARNA的预测与鉴定的预测与鉴定研究非编码研究非编码RNARNA的功能的方法的功能的方法非编码非编码RNARNA技术应用的实例技术应用的实例microRNAmicroRNAmiRNAmiRNA的分离与发现的分离与发现miRNAmiRNA的特征与功能的特征与功能miRNAmiRNA的调控机制的调控机制miRNAmiRNA靶位点预测靶位点预测miRNAmiRNA应用的实例应用的实例SELEXSELEX技术技术-指数级富集的配体系统进化技术指数级富集的配体系统进化技术 （Systematic Evolution of Ligands by Exponetial Enrichment)SE
47、LEXSELEX技术简介（概念、特点、原理）技术简介（概念、特点、原理）单链单链DNADNA文库的文库的SELEXSELEX筛选筛选单链单链DNADNA文库的文库的SELEXSELEX筛选筛选核酸的生物信息学核酸的生物信息学1 1 核酸序列数据库核酸序列数据库三大核酸序列数据库介绍三大核酸序列数据库介绍三大核酸序列数据库基本结构三大核酸序列数据库基本结构核酸序列数据库检索方法核酸序列数据库检索方法2 2 核酸序列的分析核酸序列的分析BlastBlast的使用方法的使用方法 核酸序列的双重比对核酸序列的双重比对 一一 核酸序列数据库核酸序列数据库核酸的生物信息学核酸的生物信息学二二 核酸的二级结构预测与核酸的网上资源核酸的二级结构预测与核酸的网上资源1 1 核酸的二级结构预测核酸的二级结构预测方法简介方法简介常用软件及使用方法常用软件及使用方法2 2 核酸的网上资源核酸的网上资源综合网站介绍综合网站介绍 不同领域相关网站不同领域相关网站 综述：综述：1 RNAi1 RNAi2 2 非编码非编码RNARNA3 3 合成生物学合成生物学