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1、关于免疫学检验现在学习的是第1页，共92页第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术1掌握酶免疫技术的基本原理掌握酶免疫技术的基本原理32熟悉均相酶免疫测定的类型及熟悉均相酶免疫测定的类型及 原理原理掌握掌握ELISA的原理及常用方法的类型的原理及常用方法的类型 与原理与原理熟悉酶免疫技术检测的判定熟悉酶免疫技术检测的判定4现在学习的是第2页，共92页第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术5了解酶免疫技术常用酶及底物了解酶免疫技术常用酶及底物6了解酶免疫测定的应用了解酶免疫测定的应用现在学习的是第3页，共92页酶免疫检测技术酶免疫检测技术以以酶酶标记的标记的抗体（抗原）作为主抗体（抗原）作为主
2、要试剂，将抗原抗体反应的特异性和要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催酶的高效催化化反应的专一性相结合的一种反应的专一性相结合的一种免疫检测技术免疫检测技术 一酶免疫检测技术（酶免疫检测技术（EIA）定义）定义现在学习的是第4页，共92页 酶标记抗体或抗原，和待检的抗原或抗体的免疫学进行特异性反应,形成酶标物的复合物，使底物基质水解而呈色，根据呈色反应对待检的抗原抗体作出定性定量。 很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。二酶免疫技术的基本原理酶免疫技术的基本原理现在学习的是第5页，共92页Ag -Ab-E (Ag-E -Ab) S显色反应Ag (Ab)定性、定量 、定位分析酶免疫
3、基本原理酶免疫基本原理Ab-E(Ag-E ) + Ag (Ab)现在学习的是第6页，共92页灵敏度高、特异性强、准确性好灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。衍生出适用范围更广的新方法。三酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点现在学习的是第7页，共92页 （一）酶的要求（一）酶的要求 1 1、酶活性要非常高；、酶活性要非常高； 2 2、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团；、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团； 3 3、标记后不影响酶活性及抗
4、原抗体反应性；、标记后不影响酶活性及抗原抗体反应性； 4 4、酶活性不受样品中其他成分的影响（、酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）或激活）； 四常用的酶及其底物现在学习的是第8页，共92页5 5、产物易判定或测定、产物易判定或测定6 6、不能对环境和人污染、不能对环境和人污染7 7、稳定，价廉、易得、稳定，价廉、易得。现在学习的是第9页，共92页（二）常用的酶（二）常用的酶 1、辣根过氧化物酶（、辣根过氧化物酶（HRP） 活力高、稳定活力高、稳定 现在学习的是第10页，共92页 HRP在蔬菜作
5、物辣根中含量很高，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成。 HRP的纯度用RZ表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ3.0。 酶活力以单位表示：1min将1mol的底物转化为产物的酶量为1个单位。 现在学习的是第11页，共92页2、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶AP 敏感性强敏感性强 稳定性差稳定性差 价格高价格高现在学习的是第12页，共92页3、-Gal4、 脲酶 5、葡萄糖氧化酶现在学习的是第13页，共92页（三）常用的底物（三）常用的底物 1、HRP的底物的底物 ： 四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMB 蓝色蓝色 邻苯二胺邻苯二胺OPD 黄色黄色 ABTS 蓝绿
6、色蓝绿色 现在学习的是第14页，共92页2、AP的底物的底物 对硝基苯磷酸盐对硝基苯磷酸盐 p-NPP 黄色黄色 现在学习的是第15页，共92页3 、-Gal底物 甲基伞酮基-D-半乳糖苷 （4-MUG） 均相酶免疫测定现在学习的是第16页，共92页定义定义 通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物原形成的结合物 作用：一是便于观察反应作用：一是便于观察反应 结果，二是提高测定结果，二是提高测定的敏感性。的敏感性。 五酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原1、酶标记物（酶结合物）、酶标记物（酶结合物）现在学习的是第17页，共92页酶标记物酶标记物
7、要求要求：既保有酶的催化活性；也保持了抗体（或抗原）的免疫活性；结合物尚要有良好的稳定性。现在学习的是第18页，共92页 抗原要求纯度高；抗原要求纯度高； 完全抗原完全抗原 抗体需要特异性好；抗体需要特异性好； 效价高；亲合力强以及比活性较高；效价高；亲合力强以及比活性较高； 能批量生产；能批量生产； 易纯化。易纯化。 2 2、抗原和抗体以及制备方法要求、抗原和抗体以及制备方法要求现在学习的是第19页，共92页单克隆抗体纯化的Ig抗体Fab现在学习的是第20页，共92页 技术方法简单；技术方法简单； 产率高；产率高； 重复性好；重复性好； 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；标记反应不影响酶和
8、抗原或抗体的活性； 酶标记物稳定酶标记物稳定 ； 不形成聚合物；不形成聚合物；现在学习的是第21页，共92页 过碘酸钠法过碘酸钠法-直接法直接法 常只用于常只用于HRP标记标记抗体或抗原抗体或抗原 原理：原理： 酶上的醛基和抗体上的氨基形酶上的醛基和抗体上的氨基形SCHIFF碱键。碱键。3 3、制备方法、制备方法现在学习的是第22页，共92页 戊二醛（戊二醛（GA）交联法）交联法 （间接法）（间接法）原理：原理：戊二醛交联法戊二醛是一种双功能戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂。团试剂。戊二醛的两个醛基分别和酶和抗戊二醛的两个醛基分别和酶和抗体分子中的游离的氨基和酚基以共价键形体分子中的游离的
9、氨基和酚基以共价键形式结合，形成式结合，形成SCHIFF键，将酶间接连在键，将酶间接连在抗体分子上进行标记。抗体分子上进行标记。 现在学习的是第23页，共92页优点：标记率高；优点：标记率高； 标记简单标记简单 酶利用率高；酶利用率高； 标记抗体分子质量小标记抗体分子质量小 染色效应好染色效应好 穿透能力强穿透能力强 产率高产率高 抗体活性丢失少抗体活性丢失少 酶活丢失少酶活丢失少 重复性好重复性好 缺点：标记方法复杂缺点：标记方法复杂 酶利用率低酶利用率低 穿透细胞能力一般穿透细胞能力一般 产率低产率低 抗体活性丢失较多抗体活性丢失较多 酶活力丢失较多酶活力丢失较多直接法直接法间接法间接法现
10、在学习的是第24页，共92页 原因：酶标记溶液中含有游离的酶和酶原因：酶标记溶液中含有游离的酶和酶- -酶酶 聚合物。聚合物。 方法：方法：50%50%饱和硫酸铵沉淀，再透析凝胶过滤。饱和硫酸铵沉淀，再透析凝胶过滤。4 4、酶标抗体结合物的纯化酶标抗体结合物的纯化现在学习的是第25页，共92页 酶标抗体的活性酶标抗体的活性 酶的活性酶的活性 酶标物中的酶量和抗体量酶标物中的酶量和抗体量 5 5、酶标抗体的鉴定酶标抗体的鉴定现在学习的是第26页，共92页 加甘油加甘油 低温保存低温保存5 5、酶标抗体结合物的保存酶标抗体结合物的保存现在学习的是第27页，共92页固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将
11、游离和固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面载体的表面 六固相载体固相载体现在学习的是第28页，共92页结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 结合物相当广泛（结合物相当广泛（ 亲和素亲和素 生物素生物素 抗原抗原 抗体）抗体）抗体或抗原牢固地固定在其表面，相当稳定抗体或抗原牢固地固定在其表面，相当稳定不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济1 1、
12、固相载体固相载体要求要求现在学习的是第29页，共92页2 2、固相载体固相载体种类种类塑料制品塑料制品 聚苯乙烯聚苯乙烯 微颗粒微颗粒 磁珠磁珠 膜载体膜载体 硝酸纤维膜硝酸纤维膜 NCNC现在学习的是第30页，共92页包被：包被：将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体 条件条件 PH 9.6 t=37PH 9.6 t=37度度 T=4T=4小时；小时；t=4度度 过夜过夜 抗原和抗体的浓度抗原和抗体的浓度 3 3、包被与封闭包被与封闭现在学习的是第31页，共92页封闭：用封闭：用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清将未被抗原抗体完全
13、覆盖的固相载体表面彻底包清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表面彻底包被，避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产被，避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产生非特异性吸附，而产生假阳性显色。生非特异性吸附，而产生假阳性显色。原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异性原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异性反应，本底增高。反应，本底增高。现在学习的是第32页，共92页七酶免疫技术类别 （1）酶免疫组化(IEH) 定义：酶标记已知的抗体或者抗原，然后用酶标志的抗原或抗体与组织切片中的抗体或抗原发生反应，最后与酶底物作用发生显色反应，观察出标本中的抗原或者抗体的位置和性质，并可通过图像来分析进
14、行定量。1 1、根据应用目的 现在学习的是第33页，共92页优势：能克服荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清缺陷，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。现在学习的是第34页，共92页步骤： （1） 标本的固定与保存： 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性。 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等（2） 酶消化： 打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）现在学习的是第35页，共92页3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。4、对照试验（control）： Po
15、sitive： 已知抗原阳性的切片 Negative：不含已知抗原的切片 空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生 物素等现在学习的是第36页，共92页 5 结果观察染色 特异性染色 非特异性染色显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染 色或更强显色定位 特定，有结构性 无特定部位，无结 构性 显色程度 同一部位呈不同 无分布规律，某一 程度显色 片均匀着色现在学习的是第37页，共92页 （2）酶免疫测定）酶免疫测定(EIA) 用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样液体样 品中品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。现在学习的是第38页，共92页（1 1）均相酶免疫测定）均相酶免疫测定(HE
16、I)(HEI) 定义：抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和定义：抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和酶标物的复合物，直接进行测定计算的方法。酶标物的复合物，直接进行测定计算的方法。 应用：测定小分子激素和半抗原（如药物）应用：测定小分子激素和半抗原（如药物）2 2、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和游离的酶标记物分离游离的酶标记物分离现在学习的是第39页，共92页基本原理（竞争性）基本原理（竞争性） 酶标记物抗原（抗体）和待检的抗原酶标记物抗原（抗体）和待检的抗原（抗体）（抗体）与竞争性地相应的抗原（抗体）结合后，形成了抗与竞争性地相应的
17、抗原（抗体）结合后，形成了抗原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三种物质。由于形成种物质。由于形成酶标物的结合物，酶的活性受到酶标物的结合物，酶的活性受到影响，影响，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。而确定抗原或抗体的含量。酶活性减弱或增强现在学习的是第40页，共92页+ Ag-E Ag-E -Ab+ Ag- AbAg-E + Ag + Ab（限量）竞争 酶活性酶活性或或，测定总酶活性，测定总酶活
18、性 换算可得换算可得 的含量的含量AgHEI基本原理：基本原理：现在学习的是第41页，共92页核心 竞争性结合 影响酶的活性现在学习的是第42页，共92页（A）酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMIT 定义：半抗原与酶结合成定义：半抗原与酶结合成酶标半抗元酶标半抗元，保留半，保留半抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后，所抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后，所标记的酶和抗体密切接触，由于空间阻止酶的活标记的酶和抗体密切接触，由于空间阻止酶的活力中心受到影响，而活性被抑制。力中心受到影响，而活性被抑制。现在学习的是第43页，共92页模式模式1EMIT1.AgEAb: 酶活性（Ab的空间位
19、阻，影响酶活性中心）2.游离酶(Ag- -E)有酶活性现在学习的是第44页，共92页 基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。 现在学习的是第45页，共92页ES?E半抗原半抗原EMIT原理示意图：原理示意图：ESS现在学习的是第46页，共92页EMIT基本原理基本原理: Ag竞争 Ab（限量）Ag-E正当Ag多时Ag-Ab (多)Ag-E Ab Ag-E (少) （多）酶活性S当Ag少时Ag-Ab (少)Ag-E Ab Ag-E (多) （少）酶活性酶活性现在学习的是第47页，共92页结论
20、酶活性与Ag含量呈 相关现在学习的是第48页，共92页（B）克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIA 定义定义 ： 标记了的供体酶的抗原（标记了的供体酶的抗原（ED-Ag）和）和抗体结合后，空间位阻了供酶体和酶受体的结抗体结合后，空间位阻了供酶体和酶受体的结合，从而不能形成有活力的全酶。合，从而不能形成有活力的全酶。现在学习的是第49页，共92页原理： EA 1、 酶 ED 2、形成Ag-ED-Ab时 阻止ED 和EA结合，酶活降低 模式2现在学习的是第50页，共92页3、 Ag和Ab的结合能力大于ED 和EA结合现在学习的是第51页，共92页CEDIACEDIA示意图示意图现在学习的
21、是第52页，共92页总结Ag-ED EA AbAg Ag多 Ag -Ab 如何变化Ag-ED-Ab 如何变化Ag-ED-EA 如何变化酶活 如何变化现在学习的是第53页，共92页 结论 酶的活性和样本中抗原的量正相关现在学习的是第54页，共92页（C）生物素生物素-亲和素均相酶免疫测定亲和素均相酶免疫测定 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取生物素又称维生素H，存在于蛋黄中 生物素和亲和素具有独特的结合特性 二者可偶联抗原、抗体等大分子生物活 性物质 结合迅速、专一、稳定， 现在学习的是第55页，共92页优势：优势：可极大提高检测方法的灵敏度可极大提高检测方法的灵敏度 特异性强特异性强 稳定性高
22、稳定性高 适用范围广适用范围广 实验成本低实验成本低现在学习的是第56页，共92页BA-HEI原理 要点 1、 Ag-A-Ab不能与B-E 结合， B-E 处于游离状态，保留酶的活性。 2、Ag-A- B-E后酶活性丧失。模式3现在学习的是第57页，共92页AgBA-HEI原理示意图：原理示意图：EEBSAAgAgAAgAgAEBS现在学习的是第58页，共92页总结 Ag-AB-EAgAg竞争现在学习的是第59页，共92页Ag-A-AbAg-AbAg多时B-E量Ag-A- B-E如何变化如何变化如何变化如何变化如何变化酶活现在学习的是第60页，共92页 结论 酶的活性和样本中的Ag含量呈？关系
23、现在学习的是第61页，共92页 应用 小分子激素 半抗原的测定现在学习的是第62页，共92页评价优点：1.不需分离不需分离AgAg-E-E- - AbAb和和AgAg-E-E； 2.2.简便、快速、易于自动化简便、快速、易于自动化; ; 3. 3.灵敏度高（灵敏度高（1010_ _9 9mol/Lmol/L）, ,但不及异相但不及异相 酶免疫测定。酶免疫测定。缺点：缺点： 易受内源性酶、酶抑制剂、交叉反应易受内源性酶、酶抑制剂、交叉反应 物影响而出现非特异性。物影响而出现非特异性。现在学习的是第63页，共92页 小结 酶 底物 标记方法 EIA类型现在学习的是第64页，共92页HEI 模式 不
24、需要分离酶标物的结合物和 游离态的酶标物 共同点 竞争 反应中的抗体限量现在学习的是第65页，共92页 酶活性与待测 酶标记物 标记抗原 抗原量 抗体复合物 的作用EMIT CEDIABA-HEI现在学习的是第66页，共92页（2）非均相）非均相酶联免疫酶联免疫根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分：固固相酶免疫测定：相酶免疫测定：固相预先吸附抗原或抗体，固相预先吸附抗原或抗体， 在其表面反应。在其表面反应。 液相酶免疫测定液相酶免疫测定酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)现在学习的是第67页，共92页1、酶联免疫分析技术、酶联免疫分析技术（ELISA
25、ELISA） 抗原（抗体）制成固相制剂，在与标本中抗原（抗体）反应后，只需经过固相的洗涤，抗原抗体复合物与其他物质的分离 ，再将酶标抗体（抗原）和复合物中的抗原反应，根据底物和复合物中酶的反应的颜色测定标本中的抗原的量的方法。（1）定义：现在学习的是第68页，共92页 使抗原或抗体使抗原或抗体结合到某种固相载体结合到某种固相载体表面表面，保持其免疫活性，保持其免疫活性 使抗原或抗体使抗原或抗体与与某种酶连接成酶标抗原或抗体某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性酶的活性 2 2、基本原理、基本原理现在学习的是第6
26、9页，共92页 把把受检标本受检标本（测定其中的抗体或抗原）和（测定其中的抗体或抗原）和固相固相载体表面的抗原或抗体起反应。用载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后物与其他物质分开，最后。再加入酶标记的抗。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。结合结合在在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例成一定的比例。 现在学习的是第70页，共92页 加入酶反应的底物后，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变底物被
27、酶催化变为有色产物为有色产物，产物的量与标本中受检物质，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据的量直接相关，故可根据颜色反应颜色反应的深浅的深浅进行定性或定量分析进行定性或定量分析 ELISAELISA可用于测定可用于测定抗原抗原，也可用于测定，也可用于测定抗体抗体 现在学习的是第71页，共92页底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体加入待测抗体或或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复的抗原抗体复合物合物与未结合的分离与未结合的分离1234基本原理基本原理现在学习的是第72页，共92页优点
28、： 简便、快速、敏感、特异、 实验设备简单、应用范围广、 无同位素污染现在学习的是第73页，共92页固相的抗原或抗固相的抗原或抗体体 酶标记物（酶结合酶标记物（酶结合物物） 酶反应的底酶反应的底物物 三个必要试剂三个必要试剂 3 3、方法类型、方法类型现在学习的是第74页，共92页方法：方法：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，）加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相让标本中的抗原与
29、固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。双抗体夹心法双抗体夹心法现在学习的是第75页，共92页（3 3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。检物质的量正相关。（4 4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物为有色产物。根据颜色反应进行该抗原的定性为有色产物。根据颜色反应进行该抗原的定性或定量。
30、或定量。现在学习的是第76页，共92页双抗体夹心法示意图现在学习的是第77页，共92页 （4)4)原理：原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 现在学习的是第78页，共92页根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。法测定标本中的抗体。现在学习的是第79页
31、，共92页（6）试剂在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）现在学习的是第80页，共92页(5)应用：应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等等现在学习的是第81页，共92页方法：方法：（1 1）将特异抗原与固相载体连接，形成固相抗原。）将特异抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。洗涤。（2 2）待测管中加受
32、检标本和一定量酶标抗体的混）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。竞争法竞争法现在学习的是第82页，共92页 如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗体酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，
33、酶标抗体与固相抗原的结合可抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。达最充分的量。洗涤。现在学习的是第83页，共92页（3 3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。原含量越多。范围：范围：此法可用于抗体的定量测定，也可用于测定抗原和半抗原。现在学习的是第84页，共92页1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上
34、。2.加入待检标本及酶标记抗体加入待检标本及酶标记抗体3. 形成：抗原形成：抗原-抗体复合物抗体复合物 抗原抗原-酶标抗体复合物酶标抗体复合物4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。酶酶抗体抗体酶标记酶标记 抗体抗体待检待检抗体抗体抗原抗原固相载体固相载体现在学习的是第85页，共92页竞争法测抗原竞争法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面
35、被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E现在学习的是第86页，共92页 以测定抗体为例，以测定抗体为例，受检抗体和酶标抗体竞受检抗体和酶标抗体竞争结合固相抗原争结合固相抗原，因此结合于固相的酶标，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量抗体量与受检抗体的量呈反比。呈反比。 现在学习的是第87页，共92页原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合 的受检抗体。的受检抗体。 优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测
36、各种与抗原相应的抗体应用应用 检测抗体最常用的方法，检测抗体最常用的方法，常用病毒抗体等的测定常用病毒抗体等的测定间接法间接法现在学习的是第88页，共92页方法（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。现在学习的是第89页，共92页（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 现在学习的是第90页，共92页间接法测抗体间接法测抗体- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E现在学习的是第91页，共92页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第92页，共92页