免疫学检验讲稿.ppt

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1、关于免疫学检验第一页，讲稿共九十二页哦第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术1掌握酶免疫技术的基本原理掌握酶免疫技术的基本原理32熟悉均相酶免疫测定的类型及熟悉均相酶免疫测定的类型及 原理原理掌握掌握ELISA的原理及常用方法的类型的原理及常用方法的类型 与原理与原理熟悉酶免疫技术检测的判定熟悉酶免疫技术检测的判定4第二页，讲稿共九十二页哦第二节酶免疫检测技术第二节酶免疫检测技术5了解酶免疫技术常用酶及底物了解酶免疫技术常用酶及底物6了解酶免疫测定的应用了解酶免疫测定的应用第三页，讲稿共九十二页哦酶免疫检测技术酶免疫检测技术以以酶酶标记的标记的抗体（抗原）作为主要试抗体（抗原）作为主要试剂，

2、将抗原抗体反应的特异性和剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化酶的高效催化反应的反应的专一性相结合的一种专一性相结合的一种免疫检测技术免疫检测技术 一酶免疫检测技术（酶免疫检测技术（EIA）定义）定义能定性、定位、定量能定性、定位、定量第四页，讲稿共九十二页哦 酶标记抗体或抗原，和待检的抗原或抗体的免疫学进行特异性反应,形成酶标物的复合物，使底物基质水解而呈色，根据呈色反应对待检的抗原抗体作出定性定量。很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。二酶免疫技术的基本原理酶免疫技术的基本原理第五页，讲稿共九十二页哦Ag-Ab-E(Ag-E-Ab)S显色反应Ag(Ab)定性、定量、定位分析酶酶

3、免免疫疫基基本本原原理理Ab-E(Ag-E)+Ag(Ab)第六页，讲稿共九十二页哦灵敏度高、特异性强、准确性好灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。衍生出适用范围更广的新方法。三酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点第七页，讲稿共九十二页哦（一）（一）酶酶的要求的要求 1 1、酶活性要非常高；、酶活性要非常高；2 2、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团；、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团；3 3、标记后不影响酶活性及抗原抗体反应性；、标记

4、后不影响酶活性及抗原抗体反应性；4 4、酶活性不受样品中其他成分的影响（、酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）激活）；四常用的酶及其底物第八页，讲稿共九十二页哦5 5、产物易判定或测定、产物易判定或测定6 6、不能对环境和人污染、不能对环境和人污染7 7、稳定，价廉、易得、稳定，价廉、易得。第九页，讲稿共九十二页哦（二）常用的（二）常用的酶酶 1、辣根、辣根过过氧化物氧化物酶酶（HRP）活力高、活力高、稳稳定定第十页，讲稿共九十二页哦HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁

5、血红素）结合而成。HRP的纯度用RZ表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ3.0。酶活力以单位表示：1min将1mol的底物转化为产物的酶量为1个单位。第十一页，讲稿共九十二页哦2、碱性磷酸、碱性磷酸酶酶AP 敏感性敏感性强强 稳稳定性差定性差 价格高价格高第十二页，讲稿共九十二页哦3、-Gal4、脲酶5、葡萄糖氧化酶第十三页，讲稿共九十二页哦（三）常用的底物（三）常用的底物 1、HRP的底物的底物：四甲基四甲基联联苯胺苯胺 TMB 蓝蓝色色 邻邻苯二胺苯二胺OPD 黄色黄色 ABTS 蓝绿蓝绿色色 第十四页，讲稿共九十二页哦2、AP的底物的底物 对对硝基苯磷酸

6、硝基苯磷酸盐盐 p-NPP 黄色黄色 第十五页，讲稿共九十二页哦3、-Gal底物甲基伞酮基-D-半乳糖苷（4-MUG）均相酶免疫测定第十六页，讲稿共九十二页哦定义定义 通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物原形成的结合物 作用：一是便于观察反应作用：一是便于观察反应 结果，二是提高测定的敏感结果，二是提高测定的敏感性。性。五酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原1、酶标记物（酶结合物）、酶标记物（酶结合物）第十七页，讲稿共九十二页哦酶标记物酶标记物要求要求：既保有酶的催化活性；也保持了抗体（或抗原）的免疫活性；结合物尚要有良好的稳定性。第十八页

7、，讲稿共九十二页哦 抗原要求纯度高；抗原要求纯度高；完全抗原完全抗原 抗体需要特异性好；抗体需要特异性好；效价高；亲合力强以及比活性较高；效价高；亲合力强以及比活性较高；能批量生产；能批量生产；易纯化。易纯化。2 2、抗原和抗体以及制备方法要求、抗原和抗体以及制备方法要求第十九页，讲稿共九十二页哦单克隆抗体纯化的Ig抗体Fab第二十页，讲稿共九十二页哦 技术方法简单；技术方法简单；产率高；产率高；重复性好；重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标记物稳定酶标记物稳定 ；不形成聚合物；不形成聚合物；第二十一页，讲稿共九十二页哦 过碘酸钠法过碘酸钠法-

8、直接法直接法 常只用于常只用于HRP标记标记抗体或抗原抗体或抗原 原理：原理：酶上的醛基和抗体上的氨基形酶上的醛基和抗体上的氨基形SCHIFF碱键。碱键。3 3、制备方法、制备方法第二十二页，讲稿共九十二页哦 戊二醛（戊二醛（GA）交联法）交联法 （间接法）（间接法）原理：原理：戊二醛交联法戊二醛是一种双功能戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂。团试剂。戊二醛的两个醛基分别和酶和抗戊二醛的两个醛基分别和酶和抗体分子中的游离的氨基和酚基以共价键形体分子中的游离的氨基和酚基以共价键形式结合，形成式结合，形成SCHIFF键，将酶间接连在键，将酶间接连在抗体分子上进行标记。抗体分子上进行标记。第二十三

9、页，讲稿共九十二页哦优点：标记率高；优点：标记率高；标记简单标记简单 酶利用率高；酶利用率高；标记抗体分子质量小标记抗体分子质量小 染色效应好染色效应好 穿透能力强穿透能力强 产率高产率高 抗体活性丢失少抗体活性丢失少 酶活丢失少酶活丢失少 重复性好重复性好 缺点：标记方法复杂缺点：标记方法复杂 酶利用率低酶利用率低 穿透细胞能力一般穿透细胞能力一般 产率低产率低 抗体活性丢失较多抗体活性丢失较多 酶活力丢失较多酶活力丢失较多直接法直接法间接法间接法第二十四页，讲稿共九十二页哦 原因：酶标记溶液中含有游离的酶和酶原因：酶标记溶液中含有游离的酶和酶-酶酶 聚合物。聚合物。方法：方法：50%50%

10、饱和硫酸铵沉淀，再透析凝胶过滤。饱和硫酸铵沉淀，再透析凝胶过滤。4 4、酶标抗体结合物的纯化酶标抗体结合物的纯化第二十五页，讲稿共九十二页哦 酶标抗体的活性酶标抗体的活性 酶的活性酶的活性 酶标物中的酶量和抗体量酶标物中的酶量和抗体量 5 5、酶标抗体的鉴定酶标抗体的鉴定第二十六页，讲稿共九十二页哦 加甘油加甘油 低温保存低温保存5 5、酶标抗体结合物的保存酶标抗体结合物的保存第二十七页，讲稿共九十二页哦固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相固

11、相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面载体的表面 六固相载体固相载体第二十八页，讲稿共九十二页哦结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 结合物相当广泛（结合物相当广泛（亲和素亲和素 生物素生物素 抗原抗原 抗体）抗体）抗体或抗原牢固地固定在其表面，相当稳定抗体或抗原牢固地固定在其表面，相当稳定不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济1 1、固相载体固相载体要求要求第二十九页，讲稿共九十二页哦2 2、固相载体固相载体种类种类塑料制品塑料制品 聚苯乙烯聚苯乙烯 微颗粒微颗粒 磁珠磁珠 膜载体膜载体 硝酸

12、纤维膜硝酸纤维膜 NC NC第三十页，讲稿共九十二页哦包被：包被：将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体 条件条件 PH 9.6 t=37 PH 9.6 t=37度度 T=4 T=4小时；小时；t=4度度 过夜过夜 抗原和抗体的浓度抗原和抗体的浓度 3 3、包被与封闭包被与封闭第三十一页，讲稿共九十二页哦封闭：用封闭：用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小小牛血清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表牛血清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表面彻底包被，避免载体表面对其后加入的酶标面彻底包被，避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产生非特异性吸附，而产

13、生假阳性抗体或抗原产生非特异性吸附，而产生假阳性显色。显色。原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异性反应，本底增高。性反应，本底增高。第三十二页，讲稿共九十二页哦七酶免疫技术类别（1）酶免疫组化(IEH)定义：酶标记已知的抗体或者抗原，然后用酶标志的抗原或抗体与组织切片中的抗体或抗原发生反应，最后与酶底物作用发生显色反应，观察出标本中的抗原或者抗体的位置和性质，并可通过图像来分析进行定量。1 1、根据应用目的第三十三页，讲稿共九十二页哦优势：能克服荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清缺陷，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，

14、酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。第三十四页，讲稿共九十二页哦步骤：（1）标本的固定与保存：固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性。固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等（2）酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）第三十五页，讲稿共九十二页哦3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。4、对照试验（control）：Positive：已知抗原阳性的切片 Negative：不含已知抗原的切片 空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生 物素等第三十六页，讲稿共九十二页哦 5 结果观察染色 特异性染色 非特异性染色

15、显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染 色或更强显色定位 特定，有结构性 无特定部位，无结 构性 显色程度 同一部位呈不同 无分布规律，某一 程度显色 片均匀着色第三十七页，讲稿共九十二页哦 （2）酶免疫测定）酶免疫测定(EIA)用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样液体样 品中品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。第三十八页，讲稿共九十二页哦（1 1）均相酶免疫测定）均相酶免疫测定(HEI)(HEI)定义：抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和定义：抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和酶标物的复合物，直接进行测定计算的方法。酶标物的复合物，直接进行测定计算的方法。应用：测定小分子激素

16、和半抗原（如药物）应用：测定小分子激素和半抗原（如药物）2 2、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和游离的酶标记物分离游离的酶标记物分离第三十九页，讲稿共九十二页哦基本原理（竞争性）基本原理（竞争性）酶标记物抗原（抗体）和待检的抗原酶标记物抗原（抗体）和待检的抗原（抗体）（抗体）与竞争性地相应的抗原（抗体）结合后，形成了抗原抗与竞争性地相应的抗原（抗体）结合后，形成了抗原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三种物质。体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三种物质。由于形成由于形成酶标物的结合物，酶的活性受到影响，酶标物的结合物，酶的活性受到

17、影响，标标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。或抗体的含量。酶活性减弱或增强第四十页，讲稿共九十二页哦+Ag-EAg-E-Ab+Ag-AbAg-E+Ag+Ab（限量）竞争 酶活性酶活性或或，测定总酶活性，测定总酶活性 换算可得换算可得 的含量的含量AgHEI基本原理：基本原理：第四十一页，讲稿共九十二页哦核心竞争性结合影响酶的活性第四十二页，讲稿共九十二页哦（A）酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMIT 定义：半抗原与酶结合成定义：半抗原

18、与酶结合成酶标半抗元酶标半抗元，保留半，保留半抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后，所抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后，所标记的酶和抗体密切接触，由于空间阻止酶的活标记的酶和抗体密切接触，由于空间阻止酶的活力中心受到影响，而活性被抑制。力中心受到影响，而活性被抑制。第四十三页，讲稿共九十二页哦模式模式1EMIT1.AgEAb:酶活性（Ab的空间位阻，影响酶活性中心）2.游离酶(Ag-E)有酶活性第四十四页，讲稿共九十二页哦基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。第四十五页，讲稿共九十

19、二页哦ES?E半抗原半抗原EMIT原理示意图：原理示意图：ESS第四十六页，讲稿共九十二页哦EMIT基本原理基本原理:Ag竞争Ab（限量）Ag-E正当Ag多时Ag-Ab(多)Ag-EAbAg-E(少)（多）酶活性S当Ag少时Ag-Ab(少)Ag-EAbAg-E(多)（少）酶活性酶活性第四十七页，讲稿共九十二页哦结论酶活性与Ag含量呈相关第四十八页，讲稿共九十二页哦（B）克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析CEDIA 定义定义：标记了的供体酶的抗原（标记了的供体酶的抗原（ED-Ag）和）和抗体结合后，空间位阻了供酶体和酶受体的结抗体结合后，空间位阻了供酶体和酶受体的结合，从而不能形成有活力的全酶

20、。合，从而不能形成有活力的全酶。第四十九页，讲稿共九十二页哦原理：EA1、酶ED2、形成Ag-ED-Ab时阻止ED和EA结合，酶活降低模式2第五十页，讲稿共九十二页哦3、Ag和Ab的结合能力大于ED和EA结合第五十一页，讲稿共九十二页哦CEDIACEDIA示意图示意图第五十二页，讲稿共九十二页哦总结Ag-EDEAAbAgAg多Ag-Ab如何变化Ag-ED-Ab如何变化Ag-ED-EA如何变化酶活如何变化第五十三页，讲稿共九十二页哦结论酶的活性和样本中抗原的量正相关第五十四页，讲稿共九十二页哦（C）生物素生物素-亲和素均相酶免疫测定亲和素均相酶免疫测定亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取生物素又称

21、维生素H，存在于蛋黄中生物素和亲和素具有独特的结合特性二者可偶联抗原、抗体等大分子生物活性物质结合迅速、专一、稳定，第五十五页，讲稿共九十二页哦优势：优势：可极大提高检测方法的灵敏度可极大提高检测方法的灵敏度 特异性强特异性强 稳定性高稳定性高 适用范围广适用范围广 实验成本低实验成本低第五十六页，讲稿共九十二页哦BA-HEI原理要点1、Ag-A-Ab不能与B-E结合，B-E处于游离状态，保留酶的活性。2、Ag-A-B-E后酶活性丧失。模式3第五十七页，讲稿共九十二页哦AgBA-HEI原理示意图：原理示意图：EEBSAAgAgAAgAgAEBS第五十八页，讲稿共九十二页哦总结Ag-AB-EAg

22、Ag竞争第五十九页，讲稿共九十二页哦Ag-A-AbAg-AbAg多时B-E量Ag-A-B-E如何变化如何变化如何变化如何变化如何变化酶活第六十页，讲稿共九十二页哦结论酶的活性和样本中的Ag含量呈？关系第六十一页，讲稿共九十二页哦应用小分子激素半抗原的测定第六十二页，讲稿共九十二页哦评价优点：1.不需分离不需分离AgAg-E-E-AbAb和和AgAg-E-E；2.2.简便、快速、易于自动化简便、快速、易于自动化;3.3.灵敏度高（灵敏度高（1010_ _9 9mol/Lmol/L）,但不及异相但不及异相 酶免疫测定。酶免疫测定。缺点：缺点：易受内源性酶、酶抑制剂、交叉反应易受内源性酶、酶抑制剂、

23、交叉反应 物影响而出现非特异性。物影响而出现非特异性。第六十三页，讲稿共九十二页哦小结酶底物标记方法EIA类型第六十四页，讲稿共九十二页哦HEI模式不需要分离酶标物的结合物和游离态的酶标物共同点竞争反应中的抗体限量第六十五页，讲稿共九十二页哦酶活性与待测酶标记物标记抗原抗原量抗体复合物的作用EMITCEDIABA-HEI第六十六页，讲稿共九十二页哦（2）非均相）非均相酶联免疫酶联免疫根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分：固相酶固相酶免疫测定：免疫测定：固相预先吸附抗原或抗体，固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应。在其表面反应。液相酶免疫测定液相酶免疫测定酶联免

24、疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)第六十七页，讲稿共九十二页哦1、酶联免疫分析技术、酶联免疫分析技术（ELISAELISA）抗原（抗体）制成固相制剂，在与标本中抗原（抗体）反应后，只需经过固相的洗涤，抗原抗体复合物与其他物质的分离，再将酶标抗体（抗原）和复合物中的抗原反应，根据底物和复合物中酶的反应的颜色测定标本中的抗原的量的方法。（1）定义：第六十八页，讲稿共九十二页哦使抗原或抗体使抗原或抗体结合到某种固相载体结合到某种固相载体表面表面，保持其免疫活性，保持其免疫活性 使抗原或抗体使抗原或抗体与与某种酶连接成酶标抗原或抗体某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标，这种酶标抗原或抗体既保留其

25、免疫活性，又保留抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性酶的活性2 2、基本原理、基本原理第六十九页，讲稿共九十二页哦 把把受检标本受检标本（测定其中的抗体或抗原）（测定其中的抗体或抗原）和和固相固相载体表面的抗原或抗体起反应。用载体表面的抗原或抗体起反应。用洗洗涤涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后复合物与其他物质分开，最后。再加入酶。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。载体上。结合在结合在固相载体上的酶量与标本中固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例受检物质的量成

26、一定的比例。第七十页，讲稿共九十二页哦 加入酶反应的底物后，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变底物被酶催化变为有色产物为有色产物，产物的量与标本中受检物质，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据的量直接相关，故可根据颜色反应颜色反应的深的深浅进行定性或定量分析浅进行定性或定量分析 ELISAELISA可用于测定可用于测定抗原抗原，也可用于测定，也可用于测定抗体抗体 第七十一页，讲稿共九十二页哦底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体加入待测抗体或或抗原和酶标抗抗原和酶标抗原原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复的抗原抗

27、体复合物合物与未结合的分与未结合的分离离1234基本原理基本原理第七十二页，讲稿共九十二页哦优点：简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染第七十三页，讲稿共九十二页哦固相的抗原或固相的抗原或抗体抗体 酶标记物（酶结合酶标记物（酶结合物物）酶反应的底酶反应的底物物 三个必要试剂三个必要试剂 3 3、方法类型、方法类型第七十四页，讲稿共九十二页哦方法：方法：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段）加受检标本，使之与固相抗体接

28、触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。质。双抗体夹心法双抗体夹心法第七十五页，讲稿共九十二页哦（3 3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。检物质的量正相关。（4 4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物为有色

29、产物。根据颜色反应进行该抗原的定性为有色产物。根据颜色反应进行该抗原的定性或定量。或定量。第七十六页，讲稿共九十二页哦双抗体夹心法示意图第七十七页，讲稿共九十二页哦 （4)4)原理：原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。第七十八页，讲稿共九十二页哦根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心抗原和酶标抗原结合物，即

30、可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。法测定标本中的抗体。第七十九页，讲稿共九十二页哦（6）试剂在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）第八十页，讲稿共九十二页哦(5)应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等等第八十一页，讲稿共九十二页哦方法：方法：（1 1）将特异抗原与固相载体连接，形成固相抗）将特异抗原与固

31、相载体连接，形成固相抗原。洗涤。原。洗涤。（2 2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。竞争法竞争法第八十二页，讲稿共九十二页哦 如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗体酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中

32、只加酶标与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。达最充分的量。洗涤。第八十三页，讲稿共九十二页哦（3 3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。越多。范围：范围：此法可用于抗体的定量测定，也可用于测定抗原和半抗原。第八十四页，讲稿共九

33、十二页哦1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.加入待检标本及酶标记抗体加入待检标本及酶标记抗体3.形成：抗原形成：抗原-抗体复合物抗体复合物 抗原抗原-酶标抗体复合物酶标抗体复合物4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。酶酶抗体抗体酶标记酶标记 抗体抗体待检待检抗体抗体抗原抗原固相载体固相载体第八十五页，讲稿共九十二页哦竞争法测抗原竞争法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物

34、显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E第八十六页，讲稿共九十二页哦 以测定抗体为例，以测定抗体为例，受检抗体和酶标抗体竞受检抗体和酶标抗体竞争结合固相抗原争结合固相抗原，因此结合于固相的酶标，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量抗体量与受检抗体的量呈反比。呈反比。第八十七页，讲稿共九十二页哦原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合 的受检抗体。的受检抗体。优点优点 一种酶标抗抗体检测

35、各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 检测抗体最常用的方法，检测抗体最常用的方法，常用病毒抗体等的测定常用病毒抗体等的测定间接法间接法第八十八页，讲稿共九十二页哦方法（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。第八十九页，讲稿共九十二页哦（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。第九十页，讲稿共九十二页哦间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E+第九十一页，讲稿共九十二页哦感感谢谢大大家家观观看看第九十二页，讲稿共九十二页哦