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1、实 验 三,微生物培养基的配制和灭菌,微生物培养基的配制和灭菌,目的要求 实验材料 实验程序,目 的 要 求,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角
2、瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。,实 验 程 序,培养基的配制 分离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌方法,实 验 程 序1 （培养基的配制）,培养基的种类 培养基的配制方法和步骤 三种培养基的配方及配制 无菌水的制备,实 验 程 序2 （培养基的种类）,据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培
3、养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,实 验 程 序3 （培养基的种类）,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,实 验 程 序4 （培养基的配制方法和步骤）,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭
4、菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,实 验 程 序5 （培养基的配制方法和步骤）,实验程序6 （培养基的配制方法和步骤）,实 验 程 序7 （三种培养基的配方及配制）,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 1.05kg/cm2，2530min,实 验 程 序8 （三种培养基的配方及配制）,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下： 去皮马铃薯（或鲜豆芽） 200g 蔗糖
5、（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm2 20min （含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min,实 验 程 序9 （三种培养基的配方及配制）,淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 1.05kg/cm2 30min,实验程序10 （三种培养基的配方及配制）,无菌水的制备 无菌水为下
6、一次微生物分离实验中所需要的材料。 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。,实验程序11 （分离培养微生物常用器皿的准备）,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。,实验程序12 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排
7、气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,实 验 程 序13,实 验 程 序14,实验程序15 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，
8、这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）,实验程序16 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,实验程序17 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表64。,实验程序18 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,思考题,固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 培养基中加琼脂的作用是什么？ 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？,实 验 三,结 束,