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1、微生物实验三微生物实验三 微生物培养基的配制和灭菌微生物培养基的配制和灭菌目的要求目的要求实验材料实验材料实验原理实验原理实验过程实验过程实验任务实验任务思考题思考题一、目的要求一、目的要求了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。汽灭菌法的原理及其使用方法。二、实验材料二、实验材料药品：药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H
2、2O、FeSO47H2O等。等。仪器：仪器：高压蒸汽灭菌锅、天平、牛角匙、电炉、高压蒸汽灭菌锅、天平、牛角匙、电炉、pH试纸、量筒、试纸、量筒、烧杯、漏斗、漏斗架、玻棒、三角瓶、带棉塞的无菌试管、烧杯、漏斗、漏斗架、玻棒、三角瓶、带棉塞的无菌试管、吸管、报纸、绳索、棉花、标签等。吸管、报纸、绳索、棉花、标签等。三、三、实验原理实验原理 培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基在于给微生物创造一个
3、良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。1.按组成成分可分为按组成成分可分为:合成培养基、半合成培养基、天然培养基合成培养基、半合成培养基、天然培养基2.从培养基的物理状态可分为：从培养基的物理状态可分为：液体
4、培养基：不加凝固剂液体培养基：不加凝固剂 固体培养基：加入固体培养基：加入2%左右的凝固剂左右的凝固剂 半固体培养基：加入半固体培养基：加入0.20.5%凝固剂凝固剂 3.按用途分：按用途分：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于分离和培养细用于分离和培养细菌的基础培养基，又称天然培养基。菌的基础培养基，又称天然培养基。配方如下：配方如下：牛肉膏牛肉膏 3 g 蛋白胨蛋白胨 10 g 氯化钠氯化钠 5 g 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 7.27.4 淀粉琼脂培养基
5、淀粉琼脂培养基（高氏一号高氏一号），用于分离和培），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：配方如下：可溶性淀粉可溶性淀粉 20.0 g KNO3 1.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g NaCl 0.5 g FeSO4 7H2O 0.01 g 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 7.47.6 查氏培养基查氏培养基，用于分离和培养霉菌，是，用于分离和培养霉菌，是一种合成培养基。一种合成培养基。配方如下：配方如下：NaNO3 2.0 g K2HPO4 1.0 g KCl 0.5 g MgSO4 0.5 g
6、FeSO4 0.01 g 蔗糖蔗糖 30g 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 自然自然 1、培养基的配制步骤、培养基的配制步骤:称量：称量：按照配方正确称取各种原料放在烧杯中。按照配方正确称取各种原料放在烧杯中。溶化：溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调调pH值：值：用用1N NaOH或或1 N HCl调调pH，用，用pH试纸对照。试纸对照。加琼脂溶化：加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：分装：注意不要污染棉塞。注意不要污染棉塞。包扎：包扎：包扎成捆，注明何种培养基。
7、包扎成捆，注明何种培养基。灭菌：灭菌：培养基灭菌后必须在培养基灭菌后必须在37 0C下恒温培养下恒温培养24 h，确定，确定 无菌生长，方可使用。无菌生长，方可使用。四、实验过程四、实验过程（2）加压蒸汽灭菌法原理：）加压蒸汽灭菌法原理：将待灭菌的物品放入灭菌锅，通过加热，使将待灭菌的物品放入灭菌锅，通过加热，使锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，
8、得到高于了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100 0C的温度。导致菌体蛋白质的凝固变性而达的温度。导致菌体蛋白质的凝固变性而达到灭菌的目的。到灭菌的目的。干热灭菌法：干热灭菌法：在电热烘箱（在电热烘箱（160170 0C）中灭菌）中灭菌2 h，适，适用于玻璃仪器吸管、培养基、试管等。用于玻璃仪器吸管、培养基、试管等。过滤除菌法：过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清）不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。，一般可用细菌过滤器进行除菌。紫外线灭菌法：紫外线灭菌法：一般一般30 W灯管，灯管，9 m3空间，距地面空间，距地面2 m每次打开紫外
9、线照射每次打开紫外线照射0.5 h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌：化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂酒
10、精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂.加压蒸汽灭菌步骤：加压蒸汽灭菌步骤：1.灭菌器内加入一定量的水，放入需灭菌的物品。灭菌器内加入一定量的水，放入需灭菌的物品。2.接通电源，加热。接通电源，加热。3.排冷空气，将排气阀打开，待排出大气后关闭排气排冷空气，将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。阀。4.当压力达时当压力达时0.1 MPa，温度，温度121 0C，维持，维持20 min。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出
11、物品开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。6.摆试管斜面培养基。摆试管斜面培养基。摆试管斜面培养基摆试管斜面培养基五、实验任务（五、实验任务（2人一组）：人一组）：（1）配制）配制200 ml的牛肉膏蛋白胨培养基，的牛肉膏蛋白胨培养基，用用1个大三角瓶装或者用个大三角瓶装或者用2个小三角瓶装个小三角瓶装;（2）灭菌灭菌;（3）摆试管斜面，斜面长度不超过试管摆试管斜面，斜面长度不超过试管总长的一半总长的一半.六、思考题六、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？查灭菌后的培养基是无菌的？2.配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？为什么？3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时时才能打开排气阀，开盖取物？才能打开排气阀，开盖取物？4.在使用高压灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全在使用高压灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？的因素？结结 束束