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1、生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。2.基本原理：透光度 T=It / Io 吸光度 A=lg(Io/ It) 朗伯 -比尔(1ambert-Beer) 定律 :AKLc 【K 为吸光率， L 为溶液厚度 cm ，c 为溶液浓度mol/L 】摩尔吸光系数： 1 摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度。c=A/3.定量分析：1标准曲线 (工作曲线 )法2比照法3计算法：c=A/4差示分析法适用于浓度过浓或过稀5多组分混合物测定分子吸收法 & 原子吸收法；可见光 4
2、00760 nm& 紫外光 200400 nm& 红外光大于 760 nm分光光度法；5.应用方向有机物成分分析 & 结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元素原子吸收分光光度法二.电泳技术1.定义：带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电图 1-1 光吸收示意图精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 13 页极方向按各自的速度进行泳动，使组分别离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。2.基本原理：球形质点的迁移率与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。=Q/6r3.影响
3、电泳迁移率的因素：电场强度： 电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的 pH 值：溶液的 pH 离 pl 越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大溶液的离子强度：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗： 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4.技术分类：自由电泳无支持体区带电泳有支持体 ：滤纸电泳常压及高压 、薄层电泳薄膜及薄板 、凝胶电泳琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等5.电泳分析常用方法及其特点：小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳1醋酸纤维素薄膜电泳这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾”现象别离速度快，电泳时间短样品用量
4、少经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测胰岛素、溶菌酶、胎儿甲种球蛋白（2）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用琼脂糖凝胶弹性差，不适合管状电泳用于等电聚焦、免疫电泳、血清脂蛋白等蛋白质电泳，以及DNA 、RNA 、核苷酸的分析（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节孔径大小机械强度好，有弹性分辨率高，用途广无电渗用于不同分子量蛋白质的电泳别离（4）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所
5、作的标准曲线中求出供试品的分子量最常用定性分析蛋白质的电泳方法，特别用于蛋白质纯度检测& 分子量测定精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 13 页（5）等电聚焦电泳技术利用有 pH 梯度的介质别离等电点不同的蛋白质由于其分辨率可达0.01pH 单位，因此特别适合于别离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，适合研究蛋白质的微观不均一性（6）毛细管电泳高灵敏度高分辨率高效快速样品少成本低符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的别离条件三.层析技术固定相：固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相：可以流动的物质，如水和各种溶
6、媒1.原理：当待别离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用吸附、溶解、结合等的能力不同，在两相中的分配含量比照不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。 与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。2.技术分类：按层析原理分类：按操作形式不同分类：名称别离原理吸附层析法组份在吸附剂外表吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相固相中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂结和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞
7、的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待别离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份别离名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达别离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份别离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份别离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的别离精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 13 页3.层析法的特点与应用根据层析 峰的位置及峰高或峰面积 ，可以定性及定量；析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各
8、组份的浓度或质量，同时绘出层析图；层析仪与电子电脑联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间；分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的别离分析4.应用方向柱层析、薄膜层析以硅胶/氧化铝为吸附剂 别离非极性或极性不强的有机物离子交换层析 分子量相对较小的球状蛋白的别离纯化纸层析 氨基酸、糖类、肽类、抗生素的别离排阻层析 别离纯化、分析生物大分子尤其是蛋白质亲和层析法 适用于蛋白质的别离纯化气象层析 氨基酸、脂肪酸、单糖、双糖、固醇类物质的别离，多肽、蛋白质结构的测定四.离心技术1.定义：利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数 或浮力密度
9、 的差异进行别离、浓缩和提纯的一项操作。2.基本原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质别离开。颗粒在离心力场下的沉降情况都与沉降速度和沉降时间相关，沉降时间和速度取决于：(1)离心力； (2)颗粒的大小、形状和密度；(3)沉降介质的密度和粘度。3.离心形式：(I)离心过滤： 在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质别离悬浮液的过程为离心过滤。(2)离心沉降 (或澄清)：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降别离者为离心沉降(如用于净制含少量固体的液体时也称离心澄清)；(3)离心别离： 利用不同溶质颗粒在液体各部分分布
10、的差异，别离不同比重液体的过程为离心别离。【离心过滤、离心沉降同属固-液别离，离心别离则属液 -液别离】4.应用方向普通离心机 物质的别离 &提取高速离心机 对样品中的悬浮物质进行高纯度的别离、浓缩、 精制、精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 13 页提取，多用于血液、细胞、蛋白质、病毒、激素等的别离制备超速离心机 既可以别离细胞的亚细胞器， 也可以别离生物大分子五酶学技术1.酶活性：即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好 。2.影响酶
11、活性的因素：酶浓度、底物浓度、温度、PH、抑制剂、激活剂、时间3.Km 值的应用鉴定酶的种类反映酶与底物的亲合力Km 值越大，酶与底物亲合力越小选择酶的最适底物计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率设计适宜的底物浓度4.Vmax值的应用用来计算酶的转化率 TN ，即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数5.酶学分析在临床诊断上的应用1在肝脏疾病诊断中的应用2在急性心肌梗死诊断中的应用3在急性胰腺炎诊断中的应用4在骨骼疾病诊断中的应用5在肌肉疾病诊断中的应用7在前列腺疾病诊断中的应用8在肿瘤诊断中的应用生化经典验证性实验一胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素1.实验原理：
12、白明胶胶片上蛋白质，黑色胰酶肽或氨基酸无色精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 13 页【以底片上白明胶的水解程度说明胰酶活性的高低】酶的活性受到酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂、激活剂、时间等影响2.实验操作：取试管 4 支，标上序号按顺序加入所需试剂混匀、水浴预热放入底片全部浸没水浴间歇摇动试管立即记录褪色时间(完全或部分酶浓度对酶活性的影响以酶浓度作为变量：在其他条件不变的情况下，当S E时,V 与E成正比关系。温度对酶活性的影响 先置于温度 100、 40、 0、013号管放回 40保温 ：在其他条件不变的情况下，
13、一定范围内增加温度，酶反应速度升高；超过一定的温度范围以后再增加温度，酶反应速度下降 【最适温度不是酶的特征性常数】pH 对酶活性的影响 pH 分别为 5.0、7.0、10.0 ：pH 通过影响酶或底物的电离状态，可影响酶的催化活性。 【最适 pH 不是酶的特征性常数】抑制剂对酶活性的影响分别加入NaCl、HgCl2、空白试剂 ：胰蛋白酶的抑制剂有重金属离子Hg2+，其与酶结合使酶活性降低或失活。3.注意事项：在研究一种因素对酶的活性的时，需要严格的控制反应中其他因素保持不变，只能改变要研究的某一种因素。掌握好水解程度是本实验的关键之一。HgCl2 有毒，操作时要格外小心，严防中毒。二血清蛋白
14、醋酸纤维素薄膜电泳1.实验原理：以醋酸纤维素醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 为电泳支持物，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中，血清精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 13 页蛋白全部带负电荷， 在直流电场中向正极移动， 移动速度与蛋白质所带电荷成正比，与颗粒大小成反比 。120V 电泳 45min 后，用氨基黑 10B 染色，可将血清依次分为清蛋白最远 、1-球蛋白、2-球蛋白、 -球蛋白、 -球蛋白洗脱法定量：血清蛋白组分的相对百分数=AxA总100% 清蛋白：球蛋白 =A 清
15、 A1+A2+A+A2.实验操作：准备标记 粗糙面、铅笔划线 点样粗糙面 电泳点样面向下，点样端置于负极 染色多条薄膜时应逐条浸入 漂洗注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅洗脱定量法定量 剪下各蛋白区带将洗脱液用分光光度计比色3.注意事项：点样时，应将薄膜外表多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。三丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用1.实验原理：琥珀酸脱氢
16、酶是一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝复原成无色的甲烯白。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。假设琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢， 即无法使甲烯蓝变为无色甲烯白。竞争抑制剂使酶的Km，Vmax 不变， 抑制程度取决于酶与抑制剂的相对亲精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 13 页和力&I/S 。2.实验操作：酶提取液的制备取试管6 支，编号按图步骤操作酶提取液ml磷酸缓冲液ml0.2mol/L 琥珀酸滴0.0
17、2mol/L 琥珀酸滴0.2mol/L丙二酸溶液滴0.02mol/L 丙二酸溶液滴蒸馏水滴甲烯蓝滴试管 1 2 - 8 - - - 8 3 试管 2 2 - 8 - - 8 - 3 试管 3 2 - 8 - 8 - - 3 试管 4 2 - - 8 8 - - 3 试管 5 - 2 8 - - - 8 3 试管 6 2 - 8 - - - 8 3 试管 6，在酶提取液先在100的水浴加热煮沸5min各管溶液立即混均匀， 沿试管壁 加入液体石蜡 各管置于 37的水浴中保温，切勿摇动试管 ，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间3.注意事项：酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。加入液体
18、石蜡的作用是隔绝空气，以防止空气中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。37水浴保温过程中， 不能摇动试管， 防止空气中的氧气接触反应溶液，使得复原型的甲烯白重新氧化成蓝色。实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。四猪肝中核酸的提取与鉴定1.实验原理：核蛋白的提取：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 13 页从核蛋白中提取核酸：核酸 DNA、RNA 成分的鉴定2.实验操作：匀浆制备别离抽提：将肝匀浆倒入离心管内加入2三氯醋酸 4ml， 搅拌后静置 3分钟 3000转离心 5 分钟倾去上清液，
19、向沉淀中加入95%乙醇，搅匀后置于沸水中加热2min冷却后离心5min倾去上层酒精液， 在沉淀中加入10NaCl 溶液 4ml 搅匀置于 沸水中加热 8 分钟并不断搅拌冷却后离心3000 转每分钟， 5 分钟将 上清液倒入小烧杯内取 等量的95乙醇 ，逐步滴加小烧杯内，边加边摇匀白色沉淀逐渐出现后，静置 10 分钟将小烧杯内容物倒入离心管，离心 3000 转每分钟， 5 分钟倾倒上清液即得到 核酸钠的白色沉淀RNA 与 DNA 的成分的鉴定精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 13 页3.注意事项：在离心管平衡后， 对称放入离
20、心机， 切忌将没加管套的离心管放入离心机，离心完后取出离心管防止液体洒在离心机上面或钻头上启动离心机后， 离心机如有不正常反应或噪音，应立即停止离心， 并分析原因五双缩脲法测定血清蛋白质含量1.实验原理：血清中蛋白质的多肽的肽键-CO-NH-在碱性溶液中能与2 价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。蛋白质+CuSO4+OH-紫红色络合物这种紫红色络合物在 540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。利用吸收光谱对蛋白质进行定量分析最大波长位于540nm处1标准曲线法2标准管法CX/AX=CS/AS，已知 CS，测定 A
21、S、AX，可求得 CX2.实验操作：取 7 支试管，编号，按照图1 操作并记录。混匀各管，室温放置10min ，以空白管调零，在波长540nm 比色，读取各管光吸收值。3.注意事项：须于显色后 30min 内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。空白管标准管测定管1 2 3 4 5 蛋白质标准液- 1.0 - 待测血清样本- - - - - - 1.0 氯化钠溶液1.0 - - 双锁脲试剂4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 光吸收值0 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 13 页样品蛋白质含量应在标
22、准曲线范围内。用分光光度计要注意：取吸收池时，应拿毛玻璃两面 ，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4; 不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。六纸层析法观察转氨基作用1.实验原理：氨基酸的转氨基作用实验组发生转氨基反应，最后体系中有两种氨基酸；对照组不发生转氨基反应，体系中只有一种氨基酸；纸层析法分配层析 ：滤纸支持物固定相 水流动相 乙醇有机溶剂由于混合物中的各成分的分配系数不同，别离受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度不同， 有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到别离。
23、在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速率较慢， 不同组分在纸上移动的速率不同，用Rf 表示：Rf=溶质中心到原点中心的距离/溶剂前缘到原点中心的距离物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值Rf 可用来鉴别被别离的物质。2.实验操作：肝匀浆的制备转氨基反应：取干净试管 2 支，分别标明测定管与对照管，按下表操作精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 13 页点样注意点样斑点不可太大，直径应小于0.5cm层析：在滤纸圆心处打一小孔，另取同类滤纸卷成圆筒如灯芯插入小孔；将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液中, 待溶剂
24、前沿距滤纸边缘约1/3 处，取出滤纸。显色 /染色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器向滤纸均匀喷射0.1%茚三酮溶液，再用烘烤机烘干，此时可见紫红色斑点出现，用铅笔圈下各显色点。分析结果：比较色斑的位置及色泽深浅，用铅笔描出色斑轮廓,并按下表记录有关数据,分别计算丙氨酸和谷氨酸的Rf 值及样品中氨基酸的Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。3.实验讨论与注意事项：1、从表格 1中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf 值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b 为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸； 对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸， 所以色
25、斑只有一个。2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3、点样点不宜过大，直径小于0.5cm. 七血糖的测定葡萄糖氧化酶法1.实验原理：试剂 d测定管对照管肝匀浆10 10 37水浴10min沸水浴10min 丙氨酸10 10 -酮戊二酸10 10精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 13 页葡萄糖氧化酶 (GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶(POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4- 氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度Ps:该方法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量2.实验操作：取 3 支试管 , 编号，按下表操作。混匀，置 37 水浴中保温 15 分钟，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】血清葡萄糖 (mmol/L) =( 测定管吸光度 / 标准管吸光度 ) 【正常参考范围】加入物 (ml) 空白管标准管测定管血清0. 2 葡萄糖标准液0. 2 蒸馏水0. 2 酶酚混合液精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 13 页