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1、ERK在偏头痛动物模型中的激活及与肥大细胞脱颗粒间的关系肥大细胞来自哪里 摘要：目的视察皮下注射硝酸甘油（GTN）诱导大鼠偏头痛模型中硬脑膜、三叉神经核尾部磷酸化ERK（p-ERK）的表达，及p-ERK表达与肥大细胞脱颗粒间的关系。方法24只雄性SD大鼠随机分为偏头痛模型组（n=18）和空白比照组（n=6）。模型组采纳皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组大鼠随机分为3个亚组：C48/80组（腹腔注射C48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80组（腹腔先注射SCG 10 mg/kg后再注射C48/80 2 mg/kg）和试验比照组（腹腔注射同等剂量的生理盐
2、水）；空白比照组大鼠皮下注射等量生理盐水。模型组和空白比照组分别于15 min取硬脑膜和三叉神经核尾部。用免疫组织化学染色视察大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部磷酸化ERK（p-ERK）的表达。结果ERK在模型组各亚组和空白比照组的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白比照组（P1，以及最简单致残的疾病之一,其致残性与四肢瘫痪相等同2。尽管偏头痛的发病率很高（我国患病率为0.99%，发达国家平均为12%），但其真正的病理生理学机制至今仍不清晰，对于其治疗亦存在诸多不足，即便是急性发作的特异性治疗，亦难获满足疗效。故对偏头痛的准确发病机制及治疗探讨有
3、待进一步深化进行。 细胞外信号调整激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是目前难受探讨进展中备受关注的信号转导通路。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK) 家族中的一员。在初级传入损害感受神经元四周末梢中存在丝裂原活化蛋白（MAP)激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK）是这些损害感受神经元兴奋的重要解剖学标记3,4。 肥大细胞脱颗粒能引起与其相邻的三叉神经脑膜损害感受器持续激活，而这种激活是与p-ERK表达增加相伴随的5。本试验通过建立硝酸甘油（GTN）诱导的大鼠偏头痛模型，检测p
4、-ERK的表达状况及p-ERK与肥大细胞脱颗粒间的关系，以探讨p-ERK在偏头痛发病过程中的病理生理作用，为偏头痛的治疗供应新的试验依据。 1材料与方法 1.1试验动物及分组24只健康雄性SD（250 g300 g）大鼠，随机分为模型组（n=18）和空白比照组（n=6）。模型组采纳皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组随机分为3亚组，每组6只，C48/80组（腹腔注射肥大细胞脱颗粒剂Compound48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80组（SCG,10 mg/kg后再注射C48/80，2 mg/kg）和试验比照组（腹腔注射生理盐水 2 mg/kg ），
5、模型组各亚组分别注射C48/80、SCG+C48/80、生理盐水，15 min后取硬脑膜和三叉神经核尾部标本。空白比照组大鼠皮下注射等量生理盐水，15 min后取标本。 1.2偏头痛模型制备采纳皮下注射GTN制作偏头痛模型6,大鼠按10 mg/kg颈部皮下注射GTN（广州白云山明兴制药有限公司 批号:20090505）。5 min 15 min大鼠出现双耳发红、后肢频繁挠头、爬笼次数增多等烦躁担心的现象,40 min60 min达高峰。此现象可持续1 h3 h,继之大鼠呈现蜷卧、活动削减状态。空白比照组大鼠皮下注射等剂量生理盐水。 1.3免疫组织化学将大鼠置于江湾型C立体定向仪上，取硬脑膜后取
6、脑干(A系统定位于A 0.3 mm5.7 mm,即耳间线后方0.3 mm5.7 mm) 7，将所取硬脑膜和组织块马上置于4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS固定4 h后，移入含30%的0.1 mol/L PBS液中过夜沉底（4 ）。连续冰冻切片，厚度为5 m。DAB显色、酸性甲苯胺蓝复染、脱水、透亮，中性树胶封片。阴性比照染色切片中用PBS代替一抗，其余步骤相同，结果均为阴性。 1.4图像分析采纳MIAS-2000图像分析系统,目标平均灰度级（G0)、视场平均灰度级(Gv )和目标面积与视场面积比(AAR),测试仪器的最大灰度分级(Gmax)为255,应用免疫组织化学定量计算公式计算阳性单位
7、(positive unit,PU): PU=|G0-Gv|(1-AAR)Gmax100 1.5统计学处理采纳SPSS 13.0统计软件分析。正态分布数据以均数标准差(xs)表示,多组数据比较用完全随机设计资料的方差分析、LSD-t检验。 2结果 2.1免疫组织化学染色在模型组各亚组和空白比照组的硬脑膜和三叉神经核尾部均可见p-ERK的阳性免疫反应产物，前者阳性免疫产物染色较深且主要分布于脱颗粒的肥大细胞旁边，后者阳性细胞染色较淡。即模型组各亚组大鼠硬脑膜、三叉神经尾核均有p-ERK的阳性免疫反应产物增加，镜下视察以C48/80组最为显著。 2.2PU值检测结果ERK在模型组各亚组和空白比照组
8、的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白比照组（P19和啮齿类20-22动物的硬脑膜和脑内，围绕血管四周分布，与初级损害感受神经元有较近的并置关系。在初级传入感受损害神经元中损害性刺激能引起一系列生化改变，探讨表明，在初级传入感受损害神经元四周末梢中存在MAP激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK），是这些感受损害神经元兴奋的重要解剖学标记3,4。肥大细胞脱颗粒能引起与其相邻的三叉神经脑膜损害感受器持续激活，而这种激活是与p-ERK表达增加相伴随的5。Obata等23证明在产生痛觉敏化的过程中脊髓背角ERK的激活起了关键作用。Ji等14探讨发觉
9、，ERK 在脊髓背角神经元中的激活是损害特异性的。 本试验结果显示，在空白比照组大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部内也出现少量p-ERK的表达，其缘由是在未受刺激的正常动物脑内就有ERK磷酸化的现象。偏头痛模型组各亚组内均有p-ERK的表达，且明显高于空白比照组（P 16Pietrobon D,Striessnig J.Neurobiology of migraine.Nat Rev Neurosci,2003,4:386-398. 17Strassman AM,Raymond SA,Burstein R.Sensitization of meningeal sensory neurons and t
10、he origin of headaches.Nature,1996,384:560-564. 18Waeber C,Moskowitz MA.Migraine as an inflammatory disorder.Neurology,2005,64:S9-S15. 19Artico M,Cavallotti C.Catecholaminergic and acetylcholine esterase containing nerves of cranial and spinal dura mater in humans and rodents.Microsc Res Tech,2001,5
11、3:212-220. 20Dimitriadou V,Buzzi MG,Moskowitz MA,et al.Trigeminal sensory fiber stimulation induces morphological changes reflecting secretion in rat dura mater mast cells.Neuroscience,1991,44:97-112. 21Rozniecki JJ,Dimitriadou V,Lambracht-Hall M,et al.Morphological and functional demonstration of r
12、at dura mater mast cell-neuron interactions in vitro and in vivo.Brain Res,1999,849:1-15. 22Strassman AM,Weissner W,Williams M,et al.Axon diameters and intradural trajectories of the dural innervation in the rat.J Comp Neurol,2004,473:364-376. 23Obata K,Yamanaka H.Differential activation of MAPK in injured and uninjured DRG neurons following chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats.Eur J Neurosci,2004,20:2881-2895. 作者简介：赵丽娟，女，现为山西医科高校第一医院神经内科在读硕士探讨生（邮编：030001）；牛争平（通讯作者），工作于山西医科高校第一医院（邮编：030001）。 （收稿日期：2011-01-18） （本文编辑王雅洁）