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1、-培养基配制2016010-第 18 页实验报告：实验目的、实验原理、实验步骤等1、 培养基母液的配制2、 培养基的配制（包括灭菌、包裹）3、 外植体灭菌及接种4、 实验结果观察与分析5、 继代培养基配制6、 继代培养7、 诱导发芽8、 诱导生根9、 驯化移栽10、 收获及鉴定培养基母液配置（9-25）1. 清洗器皿（初次使用注意事项）并晾干。2. 配置N6培养基等母液（每种母液体积100ml）3. 培养皿（每人至少一个）清洗、晾干、报纸包裹、线绳捆扎、灭菌烘干4. 蒸馏水灭菌天平的用法：水平调节；称重时需要关好天平所有玻璃窗。药品内部的塑料盖，记得盖上，如果不明，擦拭干净再盖上。定容：先称2
2、/3体积水，然后顺序加试剂，前一试剂溶解后，加另一试剂，最后用滴定瓶定容。值日：清洁桌面、地面；所有物品使用后归位（天平盖上罩子）；座椅归位；不迟到早退，需要的克数=（0.166g/147g）*165g （含结晶水多少）N6培养基母液1）大量营养元素（本次配制10X，母液I，每组都做，每个培养皿可盛放培养基30毫升（25-35ml），一个100毫升三角瓶可用于3个培养皿）：本次实验做100ml 10x （稀释后可制成1升培养基，可用于33个培养皿）KNO30gCaCl22H2O0.166g MgSO47H2OKH2PO400g(NH4)2SO4注：配制时按表中所列顺序逐一添加，每种成分溶解后再
3、溶解另外一种成分。1） B5微量母液：(母液II，第一组)1000ml (100X倍)含KI0.0750gH3BO300gMnSO4H2O1.0000gZnSO47H2O0. 2000gNa2MoO42H2O0.0250gCuSO45H2O0.0025gCoCl26H2O0.0025g注：本次实验各试剂用量过少，精确度不够，可全班做100ml。天平用万分之一天平（十教649）。稀释后可供100升培养基配制2） B5有机母液（每种试剂，单独一个试管盛放，）：(母液III浓度，第二组，用于30个培养基的制作）烟酸（VB3，Nicotinic acid，单独试管盛放）1g/ml（每班0.002g，加
4、入2ml蒸馏水，可制作60个培养基），）盐酸吡哆醇(VB6，单独试管盛放) 01g/ml（每班0.002g，加入2ml蒸馏水，可制作60个培养基）盐酸硫胺素(VB1，单独试管盛放) 10 g/ml（每班0.002g，加入2ml蒸馏水，可制作60个培养基）肌醇(myo-Inositol，单独试管盛放) 10 g/ml（每班称取0.2g，加入20ml蒸馏水, 可制作60个培养基）4)铁盐：(母液IV，第三组)本次实验做：100ml (100X倍)FeSO47H2ONa2EDTA2H2O注：配制顺序如下1. 称取g FeSO47H2O溶解于20ml去离子水中（A）。2. 称取g Na2-EDTA2H
5、2O溶解于20 ml去离子水中（B）。3. 将A置于70水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。4. 将A倒入C中混合，置于70水浴锅中保温2h（小时）。5. 定容至100ml。5）激素（第四组）激素溶解方法母液浓度6-BA加稀碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容1 mg/mlNAA加碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容1 mg/ml2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容（每班称取0.0050g，加入 20毫升蒸馏水，可配置60个培养皿）0.00025 mg/ml培养基配置及灭菌（10-13）移液器的使用实验步骤：1 灭菌，晾凉：培养皿、蒸馏水（开、关盖子）后，培养皿烘干。2 （2-3小时）
6、培养基配制：母液称量、添加琼脂、调节pH、导入三角瓶（100ml培养基），灭菌，凉到50-60度左右，摇匀，分别注入培养皿（培养皿的一半，要厚，提供营养，一半3个培养皿需要100ml）3 超净台风干后，保鲜膜包装，放入4度冰箱，可挑选一培养皿（包好）放于28度，进行污染观察。准备的药品（）（第一组）2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容0.25 mg/ml 10ml（第三组）1N NaOH（14N 4g溶于100 ml水中）（第三组）1N HCl（14N ml水中）（第一组）70%酒精（70 ml酒精溶于30 ml水）（一）培养基配方每3个培养基配100毫升培养液，分别放到三角瓶里，灭菌后，
7、报纸封口，每100毫升含有：母液I ：N6大量元素（10x，）：10ml母液II（B5微量）：1ml铁盐：1ml烟 酸：0.1 ml盐酸吡哆醇：0.1 ml盐酸硫胺素：0.1 ml肌 醇：1mlL-proline脯氨酸: 蔗糖：3gCH （Casein acid hydrolysate）络氨酸:2,4-D :1mlPhytagel:0.7g（1g的琼脂条）PH值：58（6）（二）培养基配置（1）在配置培养基时取适量(配置培养基总量的2/3左右)的蒸馏水放入容器内。（2）把容器放在电磁炉或者水浴锅上加热，同时加入剪断的琼脂条。 （3）不停搅拌，防止粘锅，同时加速溶解。 （4）按量称取蔗糖并加入，
8、同时搅拌。（5）待琼脂条、蔗糖完全溶解后加入母液（N6大量元素）、母液（B5微量元素）（80左右），然后搅拌均匀。 （6）加入铁盐母液IV。（7）待培养基冷却至50-60时加入有机成分，到培养基达到40时加入激素(2,4-D)。（8）加入蒸馏水定容到量(按照10个培养基计算，300 ml)，测定pH值，用0.1mol/L NaOH 或HCL 将培养基的pH调至所需数值（PH=6.0左右）。 （9）清洗培养瓶、培养盖，沥干水份。 （10）用分装器将培养基分装到三角瓶(1L 不用分装)中，趁热分装。分装时注意不要将培养基溅到容器壁口，以免引起污染。分装量根据培养材料不同而异，每瓶装入100ml（2
9、50ml三角瓶）。 11）选用合适的封口材料包扎好瓶口或盖上瓶盖。 12）在培养基瓶上贴上标签或用记号笔在瓶壁上注明培养基的代号、配制时间等，以免混淆。然后用塑料周转筐运至灭菌室准备灭菌。 13）同时对实验时所需要的解剖刀、解剖针、纱布、镊子、无菌水灯放入高压灭菌锅内灭菌。（灭菌步骤附后）14）超净台酒精擦拭，开uv，风，放入灭好菌的三角瓶和培养皿，将培养基倒入培养皿中。15）培养基冷却、风干后，包好放入4度冰箱备用。（三）高压灭菌操作步骤 1）首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 2）放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免蒸汽流通而影响灭菌
10、效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3）加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4）加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间（121摄氏度/15-20分钟）。5）灭菌所需时间到后,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培
11、养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染注意：1、锅内加的水一定要为去离子水， 以避免锅底水垢产生。2、锅内的水一定要没过底部平板，以防甘烧。3、每次灭菌之前都要检查灭菌的时间温度设置。4灭菌完毕压力未降至0时，千万不要随意打开顶盖。（四）超净工作台1.实验前将紫外灯开启20min以上。2.用棉球蘸取70%酒精将超净工作台整个空间擦拭一遍。3.进行无菌操作时，动作尽量轻柔，时刻保持无菌意识。（20-30ml）中。5.培养基过夜风干后，保鲜膜包裹，4度冰箱备用（五）无菌室无菌室应定期（每星期）用70酒精或84消毒液消毒，配合紫外线灭菌灯每次开启20分钟以上，以使无
12、菌室经常保持高度的无菌状态。外植体灭菌与接种（10-13）准备物品：酒精灯，1 （3小时）提前灭菌：50ml离心管、蒸馏水(500ml 广口瓶放入800ml水)、滤纸(锡箔纸包裹)等2 提前准备：种子去壳、70%酒精，次氯酸钠，锡箔纸，酒精灯、镊子、支架等3 （3小时）种子消毒：70%酒精，次氯酸钠，灭菌水清洗、种子放于滤纸上晾干。4 （1小时）接种：用镊子（每次夹取种子前火焰灼烧）溶液配制30%次氯酸钠溶液：V NaClO：VH2O=1：270%酒精：稀释100%或95%的乙醇至70%水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1 消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑
13、选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1） 蒸馏水清洗2） 将种子放入30ml无菌50ml离心管中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入30ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍（每次10分钟），最后一遍浸泡30分钟。 2诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12额外1014颗；3） 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30光照培养箱，4） 培养4周；5） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑
14、取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30光照培养箱，继代培养1-2周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)实验四：愈伤组织继代培养升可以配制3-4个培养皿的培养基：N6大量元素（10X）：10mlB5微量（100X）：1ml铁 盐（100x）：1ml烟 酸：0.1 ml盐酸吡哆醇：0.1 ml盐酸硫胺素：0.1 ml肌 醇：1mlL-Glu L-Glutamine：0.05 gL-pro:0.28gCH :0.03g2,4-D0.8ml蔗 糖3gPhytagel:0.40g（琼脂条1g）PH值：58粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基（每升含量）：N6大量元素（2
15、0x）：50mlB5微量(100x)：10ml铁 盐(100x)：10ml烟 酸：1 ml盐酸吡哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu L-Glutamine：0.5 gL-pro:CH :2,4-D8ml蔗 糖30gPhytagel:PH值：58实验六：诱导长芽（14）挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（30-60天）。苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗。注：分化过程中不可将愈伤继代培养。以上操作步骤皆在无菌条件下进行。粳稻分化培养基配方（每升含量）：N6大量元素：50mlB5微量：10ml铁 盐
16、：10ml烟 酸：1 ml盐酸吡哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗 糖：30gAgar 8 gPH值： 58实验七：诱导生根（15）6） 粳稻生根培养基配方（每升含量）：N6大量元素：25mlB5微量：5ml铁盐：5ml烟 酸：盐酸吡哆醇：0.5 ml盐酸硫胺素：0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar: 实验八：移栽驯化（16）锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防
17、止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。水稻苗期水培营养液配方：Macro-nutrient solution (mM)元素终浓度使用盐类分子量(g/mol)母液(103)用量(g/L)N( mM)NH4NO3100PKH2PO4K1(mM)K2SO4174Ca1CaCl22H2O147147Mg1MgSO47H2OSiO2Na2SiO39H2OMicro-nutrient solution (M) Mn9MnCl24H2OMoNa2MoO42H2OB20H3BO3ZnZnSO47H2OCuCuSO45H2OFe20FeSO47H2O+Na2_EDTA注
18、: 2 制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL母液。3 制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。4 Fe的制备：溶解 FeSO47H2O于200 mL蒸馏水，再另溶解 Na2-EDTA 200mL蒸馏水中，加热Na2-EDTA（大约70度），加入FeSO47H2O，不断搅拌，然后于70度恒温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。5 调节pH为5.5。6 铵营养时，加入硝化抑制剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。