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1、-培养基的配制及灭菌-第 5 页培养基的配制及灭菌一 实验目的1. 三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。2. 三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。3. 高温蒸汽灭菌原理的学习。4. LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。二 实验原理1. 高温灭菌的原理：由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0
2、.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意：使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。2. 培养基的配置原理：微生物的生长依赖于可利用的营养物质和适宜的生长环境。培养基是用于培养，转移，贮存微生物的固体，半固体或液体的营养物质。培养基中含有微生物所需
3、的全部营养物质，包括碳源、氮源、能源、无机盐、水分和生长因子。适宜的pH对微生物的生长是必不可少的。培养基的物理状态有三种：液体、半固体和固体。这些培养基的主要区别是在固体和半固体培养基里面加了固化剂-琼脂。当将琼脂加入溶液中时，在98能融化成有一定粘性的液体。并在42凝固。琼脂具有的特性有：不易被微生物降解；接近无色等。对于固体培养基需要加入琼脂量约为1.4%1.6%，半固体培养基加入约0.6%0.8%。培养基在配制过程中容易受到污染，因此必须进行灭菌，同时不能将培养基中的营养物质破坏。三 实验材料1. 培养基与试剂：蛋白胨，酵母粉，NaCl固体,NaOH液体,琼脂，MacConkey。2.
4、 仪器：三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒，电子称，高压蒸汽锅，电炉，药匙，称量纸，量筒或搪瓷缸，烧杯，pH试纸。四 实验步骤1. 仪器的清洗： 试剂瓶：自来水洗净，蒸馏水洗两遍，重蒸水洗两遍。 三角瓶：自来水洗净，蒸馏水洗两遍，沥干。 培养皿：自来水洗净，沥干。 试管和吸管：自来水洗净，沥干。 枪尖盒：自来水洗净，蒸馏水洗两遍，沥干。2.仪器的包装： 棉塞的制作：先取纱布，取纱布时确定纱布宽度后抽掉一根线，然后顺着先的方向撕纱布，再根据纱布的宽度和所撕下来的长度剪下大约为正方形的纱布三片，用于包棉花。根据三角瓶的口径大小，撕取大小适宜的棉花，棉花的完整面跟纱布接触，棉花碎片向里。将纱布正至
5、于三角瓶口，再降棉花内侧用大拇指顶成窝状，向纱布塞棉花，大约三分之二处在管口内，然后再用纱布的四个角系住蓬松的棉花，使其成圆形。保证取出棉塞的时候可以听到“噗”一声。 三角瓶口，试剂瓶瓶口的包装：剪下大约正方形的牛皮纸抱住三角瓶口或试剂瓶瓶口，用绳子紧绕几圈，然后沿着绳子自身缠绕方向拧断绳子，系紧后包装完毕。 吸管及涂布器的包装：吸管的尾部要塞棉花，包装的时候从头部开始。注意包装角度不要太大也不要太小。（3045最好。角度太小包装不紧，太大浪费纸），包装完后将尾巴打结。六只吸管捆扎在一起，做好标记后高压。高压后从尾巴打开。涂布器的包装与吸管类似。 培养皿的包装：将培养皿10个摆成一排，保证每个
6、皿的皿盖和皿身方向一致。用牛皮纸包扎的时候随时将两侧封口。滚动包装完后确保抛掷时培养皿不会散开。 枪尖盒的包装：方法同礼盒的包装。 试管的包装：在每只试管里面加入4.5mL蒸馏水，塞上橡胶塞，将六只试管捆扎在一起，试管口处用牛皮纸包好后用橡皮筋捆住。3.高压灭菌处理（老师讲过但并未动手操作）： 将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回内层锅，并装入待灭菌，物品装入待灭菌物品的时候注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。通电加热，并同时打开排气
7、阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。设置温度121，等待灭菌完毕。当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。4.培养基的配制及灭菌：配方-称量-配制-调pH值-过滤（可省）-分装-灭菌1) LB培养基的配制： 配方：LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，用NaOH调pH至7.2，121灭菌20min备用。LB固体培养基：除以上LB培养基成分外，还需添加1.5%琼脂，121灭菌20min备用。 称量(固体培养基300mL，液体100mL)：蛋白胨4g，酵母粉2g,NaCl4g，琼
8、脂2.25g*2。 配制和调pH值:量筒量取200ml蒸馏水于500ml烧杯或搪瓷缸中，电炉微微加热。称量培养基组分并逐一搅拌溶解。补加剩余蒸馏水，用量筒定容至400ml，转移到搪瓷杯，用NaOH调节pH值到7.58（注意pH试纸和显色图一一对照）。 分装：先装液体LB培养基：50mL/100mL两瓶。然后装LB固体培养基：150mL/300mL两瓶，分别倒入琼脂固体。然后加塞包扎。 标记后灭菌：配制好的培养基及时灭菌，否则低温保存。灭菌方法：高压蒸汽灭菌。参数：121，2030min。 摆斜面：试管固体一般摆斜面（长度小于1/2）。其他根据需要处理。 无菌检查2）MacConkey培养基的配
9、制：配方:52gMacConkey溶于1000mL蒸馏水。溶解后115高压灭菌30min。冷却至60左右，加入氨苄青霉素贮存液至终浓度50100微克每毫升，混匀后倾注平板。 称量（200mL）：称量10.4gMacConkey。 配制与分装：量筒量取200mL蒸馏水于500mL三角瓶，加入10.4gMacConkey，搅拌溶解。加塞包扎。 标记后灭菌：配制好的培养基及时灭菌，否则低温保存。灭菌方法：高压蒸汽灭菌。参数：115，30min。注：灭菌步骤参看“3.高压灭菌处理”，最后加一步：将取出的灭菌培养基放入37恒温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五 实验结果1. 三角瓶，培养皿，
10、试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器清洗干净后，将三角瓶，试剂瓶倒扣晾干，培养皿倒扣摆成两排（每排除了第一个完全倒扣，后面的倒扣搁在在前一个的边缘），枪尖盒打开盒子倒扣晾干，吸管平放晾干，试管在试管架上晾干。2. 三角瓶的棉塞制作了三个，其中500mL的三角瓶中装满了亟待灭菌的EP管，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒均已包装好等待灭菌。3. 在灭过菌的三角瓶里面，一瓶500mL的三角瓶中装了已配好的MacConkey培养基200mL，两瓶300mL的三角瓶中各装了已配好的LB固体培养基150mL,两瓶100mL的三角瓶中各装了已配好的LB液体培养基50mL,包好之后等待灭菌。4. 得到已灭菌的
11、培养基，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等。六 问题与讨论1. 清洗仪器时看清要求，注意不同的仪器用不同的水洗，也要注意洗涤次数。2. 包扎仪器的时候一定要包紧，尤其是培养皿，不能让它散落开。该加棉塞，胶塞，瓶盖的记得加上。3. 高压灭菌之前要保证锅内水面与三角搁架相平，锅内空气完全排除，灭完菌后压力降低至零再打开锅盖。4. 称量药品之前记得调零，定容时用量筒定容，不要用烧杯定容。5. 调节pH值的时候动作要慢，以免pH值大于8。6. 玻璃仪器要轻拿轻放。7. 用棉花塞吸管的时候不能塞得太紧也不要塞得过松。塞得太松灭菌效果不好，如果塞得太紧，灭完菌用的时候不容易吸入和吹出液体。8. 实验完后记得将搪瓷缸和各种用过的量筒洗干净，以免里面沾有培养基，七 参考文献1. 汪天虹，2009，分子生物学实验。2. 徐威，2014，微生物学实验。3. 沈萍，范秀容，李广武，1999，微生物学实验。