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1、微生物技术在中药炮制中的应用摘要 中药的发酵炮制是传统中药加工炮制的重要方法，起源于古老的酿酒技术，在我国具有悠久的历史。发酵炮制中药在民间应用极其广泛，对多种疾病具有良好的预防与治疗作用。经自然发酵加工而成的中药品种有六神曲、半夏曲、红曲、淡豆豉、百药煎、片仔癀等。该文对发酵炮制中药的历史起源、主要品种、微生物在炮制中的作用、加工现状以及存在的问题等进行了总结，并对中药发酵炮制的现代化发展进行了展望。关键词 中药；发酵；炮制稿件编号 20121017004基金项目 国家科技支撑计划项目（2012bai29b02）；天津市科技支撑计划重点项目（09zckfsh01100）通信作者 *高文远，教
2、授，e-mail： 发酵是中药炮制的基本方法之一，在我国具有悠久的历史，早在千余年前，我国已将微生物发酵应用于中药炮制1。经净制或处理后的药物，在一定的温度和湿度条件下，利用霉菌等微生物所分泌酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法称为发酵炮制2。发酵炮制方法，在传统中药的炮制加工中占有非常重要的地位，与其他炮制方法相比，其疗效确切，作用温和，毒副作用少，所加工的制剂被广泛应用于多种中药复方制剂或直接应用于临床疾病的治疗。1 历史与起源中药炮制是中医临床用药的一大特色，是传统中医药文化的重要组成部分。炮制，古称“炮炙”。据说文解字记载，“炮，毛炙肉也”。可见，早期的炮制主要是用火加工处理药物，
3、从而形成了中药炮制的雏形。黄帝内经中记载了法半夏等的炮制方法，是中药炮制的萌芽。而中药的发酵炮制方法则起源于我国古老的白酒酿造行业。据考证，早在六七千年前，我们的祖先便发明了使用酒曲酿制白酒的酿酒术3。书经说命篇记载，“若作酒醴，尔惟曲蘖”。曲蘖就是最早的酒曲，含有酵母菌和发芽的谷物。早期的曲仅以谷物制成，供造酒之用。后来发现曲有消谷止痢的作用，遂将其作为药物使用。本草经疏云：“古人用曲，即造酒之曲，其气味甘温，性专消导，行脾胃滞气，散脏腑风冷”。本草纲目云：“古人用麴，多是造酒之麴。后医乃造神麴，专以供药，力更胜之”。汉晋前后，发酵作为中药炮制手段出现，发展出了以中药做主要原料的药曲。张仲景
4、在金匮要略中记载了神曲的发酵炮制方法。北魏时代的贾思勰在齐民要术中记载了多种制曲方法。在药性论、肘后方、小品方、千金方等中药典籍中都有应用曲类中药的记载。发酵中药作为一种炮制、加工工艺，不但改变了煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且能够更大幅度地提高药效，改变药性，降低其毒副作用。2 发酵炮制中药的品种据药性论、本草纲目、韩氏医通、本草蒙筌等史料记载，经发酵炮制而成的传统中药包括两大类。一类是由中药与面粉混合发酵而成的曲类中药，如六神曲、建神曲、半夏曲、采云曲、沉香曲、红曲等，另一类是由中药直接发酵而成的，包括淡豆豉、百药煎、片仔癀、豆黄4等。其中曲类中药占了绝大多数，尤其是在明清时期，在半
5、夏曲的基础之上，根据韩氏医通中所述的造曲方法，又制出了皂角曲、竹沥曲、麻油曲、牛胆曲、开郁曲、海粉曲、霞天曲等10余种药曲5。据统计，本草文献中所记载的各类发酵中药制品，至今仍在临床中应用的有近20种，而2005年版中国药典中收录的有4种，包括淡豆豉、六神曲、半夏曲和百药煎6。这类中药在临床中的应用极为广泛，是许多中成药制剂的组方成分。2010年版中国药典中收录的含发酵类中药的中成药制剂有百余种之多，而部颁标准和各地方标准收载的种类则更多7。曲类中药均具有消食健胃的作用，但由于其药方组成各不相同，其功效与应用也有所区别。目前市售的以半夏为基础的药曲仅有半夏曲与霞天曲2种，其余已很少见临床应用。
6、淡豆豉始载于名医别录，由大豆的成熟种子与青蒿、桑叶一起发酵加工而成，具有解表，除烦，宣发郁热等功效8-9。百药煎始载于丹溪心法中，由五倍子、茶叶与酒曲混合发酵而成，具有清热化痰、止血止泻、生津止咳的功效10。片仔癀是来自于明代的宫廷秘方，属于国家一级中药保护品种，由田七、麝香、牛黄、蛇胆等名贵中药经微生物发酵制成。主要功能为清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛，具有很好的保肝、抗癌、抗炎效果11。3 微生物技术在中药炮制中的作用中药的发酵炮制过程实际上是一个生物转化的过程，具有选择性强，反应条件温和，转化效率高，副产物少，有效成分破坏少，毒副作用低，下游处理方便等特点。微生物在自身生长代谢过程中产生丰
7、富的胞内胞外酶，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等，能够产生酯化、氧化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、乙酰化等多种反应，分解转化原料中特定的底物生成新的活性成分，同时产生丰富的次级代谢产物。通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症，产生新的功效，提高有效成分的提取率和吸收利用率。3.1 产生次级代谢产物 微生物在生长过程中能够产生丰富的次级代谢产物。红曲霉发酵大米制造红曲时产生多种活性成分，包括红曲色素12-14、多不饱和脂肪酸15、-氨基丁酸16、麦角甾醇、抗生素、酶类、黄酮、卵磷脂等，其中最重要
8、的是monacolin类物质，这是一类胆固醇合成抑制剂，能有效降低血脂，治疗由高血脂诱发的心脑血管疾病17-20，同时还具有抗肿瘤作用21-22。六神曲发酵过程中产生的各种消化酶能够促进消化吸收23，此外淡豆豉中的大豆经芽孢杆菌发酵后产生的纤溶酶具有溶解纤维蛋白的作用24。3.2 转化原料中的化合物产生新的活性成分 微生物在生长代谢过程中分泌的酶具有广泛的催化能力，能将中药原料中的化学物质分解转化成新的成分，从而使得药物的活性增强。淡豆豉主要由大豆发酵制成，大豆中含有大豆黄素、染料木素等多种异黄酮类成分25，大多以结合型的糖苷形式存在，其中含量较高的2种糖苷为染料木苷和大豆苷。经过微生物的转化
9、作用，糖基被脱去，糖苷的含量降低，染料木素和大豆苷元等游离型的苷元含量显著升高26-27，极性减小，脂溶性增加，在人体内吸收快，具有更高的活性。研究表明，淡豆豉提取物中含有的异黄酮成分具有明显的抗氧化28、抗肿瘤29、调节血脂血糖30、防治高血压31、抗心肌缺血32、抗动脉粥样硬化33、治疗糖尿病34等作用。百药煎在发酵过程中，微生物产生的单宁酶可将原料五倍子中的鞣质转化为没食子酸，从而表现出发酵前所不具备的新的药理活性如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、利胆以及支气管扩张作用35。单宁酶已在丝状真菌、酵母、细菌、植物和动物体内发现，主要存在于黑曲霉中。关于利用微生物发酵转化中药活性成分的研究报导
10、较多，涉及的主要化学成分包括黄酮类、生物碱、萜类、皂苷类以及多酚类等36-40。3.3 降低毒性 作为一种传统的加工方法，发酵炮制常被应用于降低药物的毒副作用，经过发酵毒性成分被降解或转化为低毒物质。如半夏曲中的半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎，辛温有毒，主要毒性表现为对各种黏膜的刺激作用，可产生呕吐，咽喉肿痛失音等症状，经微生物发酵炮制成曲后其毒性减弱41。百药煎的主要成分五倍子中富含鞣质，容易与蛋白质结合形成大分子沉淀物，对胃肠道具有刺激作用。而发酵后形成的大量赖氨酸能够有效避免鞣质与蛋白质的结合，从而缓解服用后食欲减退的副作用，提高其收敛效果35。大黄经酵母菌发酵后，总蒽醌与结合型含量降
11、低，游离型蒽醌含量增加，缓和了对胃肠道的刺激，降低了泻下作用42。喜树碱具有较强的抗肿瘤活性，但其在喜树中的含量仅为0.002%，提取分离费时、费力，同时又具有严重的胃肠毒性，如抑制骨髓功能和引起出血性膀胱炎等，制约了其临床的进一步应用。通过微生物发酵将喜树碱转化为其结构类似物10-羟基喜树碱后，其对多种癌症亦具有显著的疗效，且毒副作用降低40。此外还有许多毒性中药，如马钱子、三七、雷公藤、何首乌等，通过微生物的转化作用都得到了较好的减毒效果43。3.4 增加疗效 对比生半夏、制半夏及半夏曲的功效发现，半夏只有经发酵成曲后，才具有健脾温胃消食的功效，原有的燥湿化痰功能也有所增强44。胡昌江等4
12、5用小白鼠氨水引咳、酚红祛痰、二甲苯耳廓肿胀，大白鼠皮下塑料环肉芽肿增生等方法比较了改良百药煎发酵前后的镇咳、祛痰、抗炎作用，结合体外抗菌试验，结果表明改良百药煎发酵后有更强的镇咳、祛痰、抗炎、抗菌作用。采用麻黄、莱菔子、金银花、连翘等中药材对灵芝菌进行液态发酵，其祛痰止咳效果更强46。郭芳等通过碳粒廓清试验、二硝基氟苯法和血清溶血素法等研究六味地黄对小鼠的免疫调节作用，发现其发酵液的活性明显优于煎剂47。3.5 破坏细胞壁结构 植物细胞坚硬致密的细胞壁结构是阻碍药用植物有效成分从胞内溶出，以及体内吸收的屏障。而微生物所分泌的各种胞外酶可有效地分解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶、木质素等
13、成分，从而破坏细胞壁结构，增加细胞间隙，为细胞内外的物质扩散提供传质通道，提高有效成分的提取率与吸收利用率。研究表明，经过微生物发酵后盾叶薯蓣中有效成分薯蓣皂苷元的产率明显提高48。4 发酵炮制工艺研究概况传统的发酵炮制类中药几乎都是根据前人的经验，在自然发酵条件下进行的，其中绝大部分工艺至今尚在沿用。传统的炮制加工方式生产效率低下，产品质量与药物疗效不稳定，与中药现代化国际化的发展趋势及日益增长的消费需求极不相衬，因此对传统炮制工艺的改革势在必行。目前对于发酵炮制类中药的工艺研究主要涉及以下几个方面。一是发酵菌种的分离、筛选与鉴定。不同的微生物菌种产次生代谢产物的产量与能力有着极大的差别，它
14、们的菌种特征、发酵效果也各不相同，不同菌种产生monacolin k的能力有很大差异。因此高产率、高转化率、低毒性的发酵菌种的获得是中药发酵炮制的关键因素。红曲菌能够产生monacolin类物质、红曲色素、-氨基丁酸等多种活性成分，然而其发酵过程也常常伴随着真菌毒素橘霉素的产生。因此优良发酵菌种的筛选主要侧重于高产目标产物，低产毒素的菌种49-50，以及同时产多种活性产物的菌种51，此外产单一品种红曲色素菌种的获得可以极大地简化从多种色素中分离提取单一色素的步骤52。鉴于目前多数发酵炮制类中药采取的是自然发酵方法，参与发酵的微生物种类不甚明确，对于发酵过程中的优势菌种的研究有利于阐明发酵炮制机
15、制，优化发酵工艺。韩小敏等报道百药煎的发酵主导菌为黑曲霉53，汤扬等对贵州淡豆豉进行了菌种分离鉴定，从中分离到的菌种主要为芽孢杆菌，另有少量肠杆菌和假单孢菌等污染菌54。不同产地和加工工艺制作的神曲样品中所含的微生物差异较大。胡静等从多个神曲样本中分离出大量酵母菌和少量乳酸菌55。高慧从自然发酵的神曲中分离出了枯草芽孢杆菌、毛霉和曲霉56。而福建范志神曲的主导发酵菌种为梨头霉57。芦艳卿等从六神曲中分离出的霉菌分属青霉属的分枝青霉组、曲霉属的烟曲霉组和巢曲霉组、毛霉属的总状毛霉组58。二是发酵工艺条件的优化。微生物的营养条件与培养环境对其生长与代谢产物的积累具有极大的影响。药物原材料不仅为菌种
16、提供生长所需的营养成分，而且为后续的微生物转化作用提供底物。因此，药物原料配方的组成、配比、预处理方式等都会对最终的药效产生极大的影响。通过改变料曲切块与发酵的先后顺序、向药料中加入已发酵好的曲料、以麦麸代替面粉作主料、向基质中通入流通蒸汽灭菌59等方法，能够缩短发酵周期，减少原料成本，提高产品卫生质量，解决真菌毒素污染问题。研究表明60，在厌氧条件下，红曲红色素与橘霉素的形成与初级代谢产物类似，与菌体的生成相关；而在好氧条件下，橘霉素的生成与次级代谢产物一致，主要在稳定期形成，因此对于通氧量的控制可以有效地抑制红曲霉发酵过程中真菌毒素的产生。牛丽颖等26考察了淡豆豉的原料配比、发酵温度、时间
17、、再闷时间等条件，优化后发酵时间大大缩短，大豆苷元等有效成分明显增加。杨剑芳等61探索了百药煎的制备工艺，优化了冰糖用量、ph、甜酒曲用量等条件，经过工艺改良百药煎发酵品的外观、菌丝生长及鞣质含量均明显优于改良前的效果。三是以纯种发酵代替传统的自然发酵。发酵炮制中药中优势菌群与发酵机制的深入研究为纯种发酵提供了可能。蔡琨等62采用从自然发酵的淡豆豉中分离到的菌种进行纯种发酵，发现纯种发酵淡豆豉中染料木素和大豆黄素的含量均高于自然发酵，纯种发酵可以保证淡豆豉生产的稳定性和提高产品质量。高慧56分别以芽孢杆菌、毛霉和曲霉发酵制作六神曲，酶活力与小鼠消化功能评价结果表明毛霉属菌种发酵效果最佳。经单一
18、菌种发酵的药品其有效成分的含量明显高于自然发酵品，原因是抑制了有害杂菌对发酵基质中营养成分的竞争性消耗，且产品质量稳定，也避免或降低了真菌毒素的污染。此外，以液态发酵代替固态发酵也是中药发酵炮制的一个发展方向。随着药物有效成分及其药理活性越来越多地被阐明，发酵炮制中药的生产与应用逐渐转向某些特定的有效成分。液态发酵法与固态发酵法相比生产效率高，易于自动化控制。但是由于液态发酵有效成分的产量和转化效率还比较低，目前多数还不能应用于工业化生产。有关红曲通过液态发酵提高有效成分产量的研究较多12，60，63-64。对于有效成分的提取条件的改进，检测指标的确定与产品质量分析等也有报道23，58，65-
19、66。5 存在的问题传统的中药发酵炮制方法生产效率低下，生产周期长，占地面积大，产品卫生质量差。采用的是多菌种混杂的自然固态发酵，参与发酵的微生物种类和数量难以控制，因而存在菌种不纯、针对性不强等缺点，微生物在发酵过程中的潜在效能未能得到最大限度地发挥。由于空气、药材原料以及加工器具中含有大量的杂菌，产品污染较为严重55，65，除了含有对发酵炮制有促进作用的有益菌种外，许多药物中还含有大量杂菌，甚至包括一些致病菌，以及产生真菌毒素的菌种14。1995年法国学者blanc从红曲霉monascus purpureus培养物中分离出桔霉素，它是一种真菌毒素，对肾脏有较强的毒性作用，还可以导致畸形，过
20、量还可使动物致死67。桔霉素的发现极大地阻遏了红曲霉的开发利用，日本和欧洲各国均制定了橘霉素的限量标准。因此如何降低或消除桔霉素产量的研究也成为各国学者们亟待解决的一项工作。另外各地方药材标准在处方组成、制作工艺等方面各不相同，因此制成的产品质量差异很大，药效也难以保证。此外，由于目前对于发酵炮制类中药的药效物质基础研究还不够深入，其作用机制不甚明确，因此绝大部分品种，即使是化学成分相对明确的红曲和淡豆豉等药材，也没有合理的质量评价指标，质量鉴定主要凭借感观标准和经验判断。黄国能23检测了国内13个省市生产的神曲和建曲等药曲中的消化酶，认为用蛋白酶和淀粉酶这2种消化酶作为指标来衡量神曲等药曲的
21、内在质量和工艺方法比较可行。6 展望发酵类中药在我国的临床应用非常广泛，虽然近年来在活性成分、药理研究以及加工技术等方面都取得了一定的进展，然而由于发酵炮制中药具有化学成分复杂，药效多样，作用机制不明确，以及微生物菌种多样性等特点，对于其发酵作用的研究仍然处于起步阶段，无论是在基础理论还是在实际应用方面。因此要使发酵类中药适应中药现代化发展的需要，必须加强药物活性成分研究，借鉴中药生物转化作用与微生物体外代谢模型研究的成果与经验68，探索中药材发酵过程中主要成分的变化规律，明确发酵炮制作用的机制；同时深入药理作用机制研究；在此基础上，建立科学合理的质量评价体系；规范生产工艺，在传统中药发酵炮制
22、理论的基础上，应用现代微生物工程技术，提高微生物的转化效率，提高产品的质量。在优良菌种选育及纯种发酵的基础上，建立多菌种混和发酵模式，将会极大地提高产品质量稳定性、可控性，提高产品的药效与安全性。参考文献1 李羿， 万德光.试论传统中药的发酵炮制j.成都医学院学报，2006，1（2）：99.2 王延年， 刘晓秋.现代中药炮制m.北京：人民军医出版社，2008：207.3 方心芳.曲蘖酿酒的起源与发展，科技史文集. 第4集 m. 上海科技出版社，1980.4 葛喜珍.发酵在中药研究中的应用j.时珍国医国药，2008，19（2）：386.5 傅超美， 冷静.中药发酵的概况与关键技术j.中国药业，2
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48、f traditional chinese medicines（tcms）， as an important processing method for tcm， originated from the ancient brewing technology. it has a long history in china. fermented tcms（ftcms） are widely applied among folks for preventing and treating many diseases. there are many kinds of tcm processed by spontaneous fermentation， includi