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1、生物技术在食品致病微生物检测中的应用第1页，本讲稿共20页食品中致病微生物的检测技术食品中致病微生物的检测技术分子生物学技术运用到有食品检测方面，分子生物学技术运用到有食品检测方面，主要是针对一些有害微生物的核酸进行研主要是针对一些有害微生物的核酸进行研究通过核酸杂交和核酸合成等反应快速检究通过核酸杂交和核酸合成等反应快速检测样品中是否含有特定的有害微生物，并测样品中是否含有特定的有害微生物，并进一步确定其含量，其中最主要的技术包进一步确定其含量，其中最主要的技术包括括PCR技术、技术、DNA探针技术和基因芯片技探针技术和基因芯片技术。术。第2页，本讲稿共20页1.聚合酶链反应（聚合酶链反应（
2、PCR）（1）传统）传统PCR技术技术聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reation,PCR)是是1985年诞生的一项体外扩增年诞生的一项体外扩增DNA的的方法，是在模板方法，是在模板DNA、引物和四种脱氧核、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合聚合酶的酶促合成反应，体外扩增特异酶的酶促合成反应，体外扩增特异DNA片片段的技术。通过对人工难以培养的微生物段的技术。通过对人工难以培养的微生物相应相应DNA 或或RNA 片段的扩增，检测扩增产片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速的对饲料中致病菌含量物含量，从而快速的对饲料中
3、致病菌含量进行检测。进行检测。第3页，本讲稿共20页李秀娟等（李秀娟等（2009年）对年）对117 株金黄色葡萄球菌株金黄色葡萄球菌的的nuc片段进行了片段进行了PCR 扩增和焦磷酸测序，结果扩增和焦磷酸测序，结果显示所建立的显示所建立的PCR 方法能对方法能对117 株金葡菌进行准确株金葡菌进行准确检测，焦磷酸测序结果的一致性进一步验证了检测，焦磷酸测序结果的一致性进一步验证了PCR 扩增结果的特异性，说明该方法针对目前所用扩增结果的特异性，说明该方法针对目前所用的研究菌株而言，尚未出现假阳性和假阴性结的研究菌株而言，尚未出现假阳性和假阴性结果，具有较高的特异性。果，具有较高的特异性。第4页
4、，本讲稿共20页传统传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺技术在实际应用中表现出一些缺陷，例如只能定性而不能定量地检测，且陷，例如只能定性而不能定量地检测，且在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生的毒素等。不能检测致毒微生物产生的毒素等。随着各项新技术的出现以及与随着各项新技术的出现以及与PCR技术的技术的有机结合，发展起来了一系列改进的有机结合，发展起来了一系列改进的PCR技术。技术。目前应用的方法主要有实时荧光定量目前应用的方法主要有实时荧光定量PCR、多重多重PCR以及以及PCR联合技术等。联合技术等。第5页，本讲稿共20页实时
5、荧光定量实时荧光定量PCR实时定量实时定量PCR技术是指在技术是指在PCR反应体系中反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。该方法可以对知模板进行定量的方法。该方法可以对GMO 进行定量分析，目前已被一些国家的进行定量分析，目前已被一些国家的政府实验室采用。政府实验室采用。第6页，本讲稿共20页杨柳等（杨柳等（2011年）根据沙门氏菌年）根据沙门氏菌fimY 基因基因序列设计引物和探针序列设计引物和探针,采用基因重组技术构采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定
6、量标准品，成功建用于沙门氏菌检测的定量标准品，成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量菌实时荧光定量PCR 方法，具有较好的特方法，具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性。异性、敏感性、稳定性和重复性。第7页，本讲稿共20页多重多重PCR多重多重PCR是常规是常规PCR方法的改进，它是在方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。徐伟等应性，并且能降低检测成本。徐伟等（2009年）针对单增李斯特菌转录
7、调节子年）针对单增李斯特菌转录调节子基因基因prfA 和志贺氏菌侵袭性质粒抗原和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H 基基因因ipaH 设计引物，设计引物，采用多重采用多重PCR 对两种对两种致病菌进行同步鉴定，提供了一种快速且致病菌进行同步鉴定，提供了一种快速且特异性高的同步检测单增李斯特菌和志贺特异性高的同步检测单增李斯特菌和志贺氏菌的方法。氏菌的方法。第8页，本讲稿共20页PCR联合技术联合技术传统传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺陷，采用技术在实际应用中表现出一些缺陷，采用一些新技术与一些新技术与PCR结合，对结合，对PCR技术的完善和发展提技术的完善和发展提供了有力的支持，并应用在致病菌检测
8、中。供了有力的支持，并应用在致病菌检测中。王永等（王永等（2009年年)探讨以探讨以16S rDNA 保守区段为保守区段为PCR扩扩增对象，运用增对象，运用SSCP技术对致泻大肠埃希氏菌、沙门氏技术对致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进行单链构象多菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进行单链构象多态性分析，为食源性致病菌的快速鉴定提供方法依据。态性分析，为食源性致病菌的快速鉴定提供方法依据。第9页，本讲稿共20页刘成志等（刘成志等（2009年）根据志贺氏菌年）根据志贺氏菌ipaH 基因的保守序基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的列设计特异性引物，筛选合适的DNA 模板
9、制备方法，模板制备方法，采用快速常规采用快速常规PCR 和定量实时和定量实时PCR 结合，对培养液结合，对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测，建立乳中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测，建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。杨大伟等（杨大伟等（2011年）应用年）应用PCR 结合变性高效液相色谱结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，以技术，以A 型肉毒梭菌的型肉毒梭菌的A 型肉毒神经毒型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物，素基因作为靶基因设计特异性引物，PCR 扩增的产扩增的产物经物经DHPLC 技术进行快速检测，最低检出限可达技术进行快
10、速检测，最低检出限可达到为到为111ng/tube，该方法可以快速、准确检测，该方法可以快速、准确检测A 型肉型肉毒梭菌。毒梭菌。第10页，本讲稿共20页2.核酸探针技术核酸探针技术根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为其分为DNA探针、探针、RNA探针和寡核苷酸探探针和寡核苷酸探针，其中针，其中DNA探针是最常用的核酸探针。探针是最常用的核酸探针。DNA 探针技术又称分子杂交技术，是利用探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性的高度精确性，对某一特异性DNA序列进序
11、列进行探查的新技术。行探查的新技术。第11页，本讲稿共20页微生物经过处理后固定于另一固相表面上微生物经过处理后固定于另一固相表面上,经洗涤变性后加入经洗涤变性后加入DNA探针进行杂交，探针进行杂交，DNA探针可以与同源性的靶探针可以与同源性的靶DNA进行互补进行互补性结合，依据指示剂选用合适的方法进行性结合，依据指示剂选用合适的方法进行检测。目前，检测。目前，DNA探针技术已经在沙门氏探针技术已经在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中得到了应用。检测中得到了应用。第12页，本讲稿共20页续文彬续文彬(2008年年)针对单增李斯特氏菌针对单增李斯
12、特氏菌hly部分基因设计探部分基因设计探针，对肠炎沙门氏菌，大肠埃希氏菌，绿脓假单抱病菌，针，对肠炎沙门氏菌，大肠埃希氏菌，绿脓假单抱病菌，空肠空肠/结肠弯曲杆菌等非单增李斯特氏菌经杂交保护结肠弯曲杆菌等非单增李斯特氏菌经杂交保护分析后，只有单增李斯特氏菌为阳性结果，具有较分析后，只有单增李斯特氏菌为阳性结果，具有较好的特异性。好的特异性。薛力刚等（薛力刚等（2010年）通过吖啶酯标记核酸探针的方法年）通过吖啶酯标记核酸探针的方法检测病原菌，核酸探针与待检样品中金黄色葡萄球检测病原菌，核酸探针与待检样品中金黄色葡萄球菌的菌的rRNA 序列进行杂交，形成稳定的序列进行杂交，形成稳定的DNA:RN
13、A 杂杂交体，使用碱液破坏未杂交探针，在碱性过氧化氢中检测交体，使用碱液破坏未杂交探针，在碱性过氧化氢中检测发光。核酸探针法检测金黄色葡萄球菌大大缩短了检测周发光。核酸探针法检测金黄色葡萄球菌大大缩短了检测周期，且特异性和敏感性较高，为金黄色葡萄球菌的鉴定提期，且特异性和敏感性较高，为金黄色葡萄球菌的鉴定提供了一种新方法。供了一种新方法。第13页，本讲稿共20页3.基因芯片技术基因芯片技术基因芯片的主要原理是指将各种基因寡核基因芯片的主要原理是指将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与扩增后制备荧光标记探针，然后
14、再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过检测杂芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过检测杂交信号的强度及分布确定检测样品中特定交信号的强度及分布确定检测样品中特定微生物的存在。与传统的微生物检测方法微生物的存在。与传统的微生物检测方法相比，基因芯片技术先进性主要体现在高相比，基因芯片技术先进性主要体现在高通量检测、简便快速、敏感性高等方面，通量检测、简便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面的重大技术突破。是食品安全方面的重大技术突破。第14页，本讲稿共20页 陈昱等陈昱等(2009年年)利用芯片技术对志贺氏菌等利用芯片技术对志贺氏菌等26株食株食源性微生物进行检测，最后成功建立了检测和鉴定志源性微生物进行检
15、测，最后成功建立了检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法，为的方法，为3种食种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。敏的方法。贺晨等（贺晨等（2011年）筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒年）筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌沙门氏菌、大肠杆菌O157等等11种特异基因作为目的基因，种特异基因作为目的基因，建立了一种运用多重建立了一种运用多重PCR 方法结合基因芯片技术快速、方法结合基因芯片技术快速、准确检测准确检测11 种常见致病菌的方法，为流行病学调查和传种常见致病菌的方
16、法，为流行病学调查和传染性疾病的早期诊断和判定提供了一种有效的检测手段。染性疾病的早期诊断和判定提供了一种有效的检测手段。第15页，本讲稿共20页 陆长勇（陆长勇（2009年）针对金黄色葡萄球菌、年）针对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌等副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌等8种种常见的食源性致病菌建立了基于单碱基延常见的食源性致病菌建立了基于单碱基延伸标签反应原理的基因芯片检测方法，其伸标签反应原理的基因芯片检测方法，其灵敏度可达到灵敏度可达到0.1pg，以鼠伤寒沙门氏菌为，以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测对象的细菌纯培养物灵敏度可达单一检测对象的细菌纯培养物灵敏度可达到到5102 C
17、FU/mL。第16页，本讲稿共20页结语结语生物技术因其低成本、高效、高通量和高生物技术因其低成本、高效、高通量和高特异性等特点已经渗透着食品检测领域，特异性等特点已经渗透着食品检测领域，其优越性日趋明显，成为未来食品安全检其优越性日趋明显，成为未来食品安全检测中的主力军。但每种方法难免有其局限测中的主力军。但每种方法难免有其局限性，在应用中需依具体需要进行选择或搭性，在应用中需依具体需要进行选择或搭配使用，也期待各种方法的优化和新技术配使用，也期待各种方法的优化和新技术新方法的问世，从而为人们赖以生活的食新方法的问世，从而为人们赖以生活的食品提供安全和营养的可靠保障。品提供安全和营养的可靠保
18、障。第17页，本讲稿共20页参考文献1 李秀娟,徐保红,田会方等.基于PCR的金葡菌准确检测方法的建立及应用J.中国人兽共患病学报,2009,25(5):442-445.2 杨柳,苏明权,马越云等.荧光定量RT-PCR 检测沙门氏菌方法的建立J.中国实验诊断学,2011,15(1),17-20.3徐伟,刘军,李素芳.单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR 检测技术的建立J.中国食品学报,2009,9(1):201-207.4 王永,赵新，兰青阔，朱珠,程奕.4种食源性致病菌的PCR-SSCP检测技术研究J.天津农业科学,2009,15(1):13-15.5 刘成志，钱凯，李洁莉等.乳饮料中志贺氏菌的
19、快速PCR检测技术研究J.研究报告,2009(1):1-5.第18页，本讲稿共20页6杨大伟,刘云国,谭乐义.食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法的建立J.食品工业科技,2011(6):398-400.7 续文彬.单增李斯特氏菌液相核酸探针检测方法的建立与初步应用.吉林农业大学硕士学位论文,2008,28-31.8 薛力刚,刘金华,王全凯.金黄葡萄球菌核酸探针检测方法的建立J.中国生物制品学杂志.2010,23(1):91-94.9 陈昱,潘迎捷,赵勇等.基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立J.微生物学通报,2009,36(2):285-291.10 贺晨,孙鸿燕,邵丽筠等.多重PCR 结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立.中国实验诊断学,2011,15(4):587-591.11 陆长勇,施春雷,张春秀等.基于单碱基延伸标签反应的常见食源性致病菌基因芯片检测方法的建立J.生物工程学报,2009,25(4):554-559.第19页，本讲稿共20页谢谢观赏谢谢观赏第20页，本讲稿共20页