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1、第五章第五章 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞 外源目的基因与载体在体外连接重外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组组后形成重组DNADNA分子，该重组分子，该重组DNADNA分子必须导入适宜的受体细胞中方分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或能使外源目的基因得以大量扩增或表达。表达。外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达 表达表达连接连接转化或转导转化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞基因的重组与转移基因的重组与转移 DNADNA体外连接应注意的事项：体外连接应注意的事项：1. 插
2、入片段与载体的酶切位点互补插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。决不能进行非互补粘性末端连接。决不能进行非互补粘性末端连接。第一节、第一节、DNADNA片段的体外连接片段的体外连接EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3A、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确插入的方向正确（1）用双酶切）用双酶切由于产生的粘性末端不同，由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接
3、。只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI 当外源当外源DNA以非定向的方式插入克隆载体时，需以非定向的方式插入克隆载体时，需用测序或酶切的方法确定插入方向，上述两种方用测序或酶切的方法确定插入方向，上述两种方法或昂贵或费力。一种快速、简便的法或昂贵或费力。一种快速、简便的PCR法，即法，即利用载体的通用引物和目的片段的两个特异性引利用载体的通用引物和目的片段的两个特异性引物直接扩增重组菌落，从而达到鉴别物直接扩增重组菌落，从而达到鉴别DNA插入方插入方向的目的。向的目的。 3. 插入基因的开放阅读框（插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA
4、定位插入载体定位插入载体（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时起始密码的时候，更要注意。候，更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片段插入片段EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！4. 防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体5 3 载体载体插入片段插入片段载体和外源载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果受体细胞：受体细胞： 原核生物细胞原核生物细胞 真核生物细胞真核生物细胞 酵母菌细胞酵母菌细胞
5、 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞第二节、重组第二节、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌大肠杆菌受体细胞的选择大肠杆菌受体细胞的选择1、重组缺陷型：重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便避免与受体基因组进行同源重组，便于重组于重组DNA独立存在独立存在 2、限制缺陷型限制缺陷型: 避免修饰和降解，使重组避免修饰和降解，使重组DNA稳定存稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化率率 4、遗传互补型：遗传互补型：有明显的选择性差异有明显的选择性差异 ，有利于重组体，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达筛选具有较好
6、的翻译后加工，有利于真核基因表达 6、感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因防止感染，安全性高，无致病基因使用丧失了使用丧失了限制修饰体系限制修饰体系的大肠杆菌。如的大肠杆菌。如K12系系列的大肠杆菌。列的大肠杆菌。1. 菌种，大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌菌种，大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌2. 外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（1）转化（）转化（transformation) 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 （2）转染（）转染（transfec
7、tion)噬菌体、病毒或以它们为载体构建的噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNADNA重组体直接导入受体细胞而获得新的遗传重组体直接导入受体细胞而获得新的遗传表型。表型。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因转移及基因重组即为转导作用。重组即为转导作用。（3）转导（）转导（transduction)用用CaClCaCl2 2处理大肠杆菌，细菌表面正电荷增加，细胞壁处理大肠杆菌，细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于
8、和膜的通透性增加，利于DNADNA分子的吸附和吸收能增加分子的吸附和吸收能增加膜的通透性。膜的通透性。3、感受态大肠杆菌的制备、感受态大肠杆菌的制备当细菌处于当细菌处于00、二价阳离子（如、二价阳离子（如CaCa2+2+、MgMg2+2+等）等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的受态；此时转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的酶的羟基羟基- -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNADNA在在4242短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于进入，在丰富
9、培养基中生长数小时后，球状细进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。胞恢复原状并繁殖。 制备原理制备原理 制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mM CaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬3. 重组质粒导入受体的重组质粒导入受体的转化方法转化方法 大肠杆菌在大肠杆菌在0 CaCl20 CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀
10、成球形，低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNaseDNase的羟基磷酸钙复合物的羟基磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经粘附于细胞表面，经4242短时间热激处理，促进细胞吸短时间热激处理，促进细胞吸收收DNADNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。养基平板上可挑选所需的转化子。简单简单，但转化效率不，但转化效率不高（高（10106 6-10-108 8/ / gDNAgDNA）。）。（1）热激法或）热激法或热休克转化法热休克转化法( Heat shock transfor
11、mation ) 10ng载载体体DNA100 L感感受态菌受态菌 On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1.5分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（2）电转化法）电转化法转化效率高（高于转化效率高（高于109/ gDNA）。）。在高压脉冲下，外加于细胞膜上的电场造成在高压脉冲下，外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，离子和水进入细菌细胞，也有利于也有利于DNA等大等大分子进入。分子进入。
12、脉冲过后，微孔复原，在丰富培脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。得到大量复制。LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心集菌心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心收集菌心收集菌体体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA On ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速中
13、速震荡震荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化（3） 平板平板培养细菌培养细菌10-100 L转转化液化液涂于含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜环形重组质粒环形重组质粒 质粒自我连接质粒自我连接线性载体或线性载体或DNADNA片段进入细菌会被降解。片段进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 4.转化率和转化率和影响转化率的因素影响转化率的因素每每 gDNA转化成功的细菌克隆数转化成功的细菌克隆数总受体细胞所获的转化成功的细菌数总受体细胞所获的转化成功的细菌数生长状态生长状态对数生长期的菌对数生长期的菌 4储存感受态菌
14、要在储存感受态菌要在-70以下以下CaClCaCl2 2处理要充分处理要充分使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells) 转化率高的菌株；转化率高的菌株； 有突变的菌株（互补）；有突变的菌株（互补）； 不育的菌株（不会接合）不育的菌株（不会接合）一、酵母细胞一、酵母细胞1. 菌株选择菌株选择如：如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his31三、重组三、重组DNADNA导入真核细胞导入真核细胞（1）利用原生质体进行转化）利用原生质体进行转化 2. 酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵
15、母原生质体原生质体感受态感受态蜗牛消化酶蜗牛消化酶去壁去壁CaCl2、 PEG插入外源基因插入外源基因 的重组载体的重组载体转化转化 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的重组载体插入外源基因的重组载体感受态感受态40% PEG 4000（2）利用）利用Li+ +盐进行转化盐进行转化消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、植物细胞二、植物细胞1.农杆菌介导法农杆菌介导法植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织
16、幼苗幼苗分化分化2. 电击法（电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附基因枪基因枪射击植物射击植物装入装入3.基因枪法（基因枪法（gene gun） （1）原理：）原理：三、哺乳动物细胞三、哺乳动物细胞1. 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPESHEPES缓冲盐水与含有氯化钙和缓冲盐水与含有氯化钙和DNADNA的溶液缓的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和慢混合，会形成含磷酸钙和DNADNA的沉淀，倒的沉淀，倒入培养细胞平皿，入培养细胞平皿，DNADNA和磷
17、酸钙形成共沉淀和磷酸钙形成共沉淀物，黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面，物，黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就可被细胞捕获。就可被细胞捕获。依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。不需要载体。不需要载体。（2）特点：）特点： 脂质体脂质体(liposomes(liposomes) )是一种人造磷酸双分子膜。是一种人造磷酸双分子膜。包装成脂质体的包装成脂质体的SV40 DNASV40 DNA的感染性，至少要比其的感染性，至少要比其裸露裸露DNADNA高出高出100100倍，用它包装的倍，用它包装的DNADNA在在44可长
18、期可长期保存不失活性，可保护保存不失活性，可保护DNADNA免受核酸酶的降解作用。免受核酸酶的降解作用。 以脂质体为载体的基因转移通常是先用以脂质体为载体的基因转移通常是先用PEGPEG处处理培养的动物细胞，使之易于吸收脂质体。正常理培养的动物细胞，使之易于吸收脂质体。正常情况下，每个细胞平均可吸收情况下，每个细胞平均可吸收10001000个左右。个左右。 2. 脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂质体有商业试剂盒脂质体有商业试剂盒（如（如Life Technologies）。）。脂质体包埋脂质体包埋DNA，通，通过与细胞膜融合进入过与细胞膜融合进入细胞细胞直接把外源直接把外
19、源DNA注射到宿主雄细胞核里，注射到宿主雄细胞核里，使其整合到染色体上。使其整合到染色体上。3. 显微注射法显微注射法(microinjection) 二乙胺乙基葡聚糖二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran, DEAE-dextran)是一种高分子多聚阳离子试剂，能促是一种高分子多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源进哺乳动物细胞捕获外源DNA。其机理可能是因为葡。其机理可能是因为葡聚糖与聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，的作用，也可能葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞作用。也可能葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞
20、作用。 DEAE-dextran转染主要有转染主要有2种不同的方法。一种是种不同的方法。一种是受体细胞先用受体细胞先用DEAE-dextran溶液预处理，然后再与转溶液预处理，然后再与转染的染的DNA接触；另一种是先使接触；另一种是先使DNA直接同直接同DEAE-dextran混合，形成混合，形成DNA/DEAE-dextran复合物后，再复合物后，再用来处理细胞。用来处理细胞。 4. DEAE-葡葡聚聚糖转染法糖转染法细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE对细胞有毒对细胞有毒!葡聚糖葡聚糖二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外二乙氨乙基葡聚
21、糖能促进哺乳动物细胞摄入外源源DNADNA。12吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可可以进入到细胞核里。以进入到细胞核里。 本章思考题（本章思考题（3）1 1、重组、重组DNADNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？分子在导入受体前如何保证插入的正确？2 2、受体的选择有什么要求？、受体的选择有什么要求？3 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？4 4、导入植物细胞的方法有哪些？、导入植物细胞的方法有哪些？5 5、导入动物细胞的方法有哪些？、导入动物细胞的方法有哪些？6 6、简述各种重组、简述各种重组DNADNA导入法的优缺点。导入法的优缺点。