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1、第五节 目的基因与载体连接基因工程之基因工程之“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接）质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共
2、安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法工工具酶：具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于基因工程中的工具酶主要包括用于DNADNA和和RNARNA分分子子的切割、的切割、连接、连接、聚合、逆聚合、逆转录等转录等相关的各种酶类。相关的各种酶类。几种重要的工具酶几种重要的工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割识别特异碱基序列，切割DNA DNA DN
3、A DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成cDNA cDNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除切除5 5 末端磷酸末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚尾端合成同聚尾“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公
4、共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 DNA连接酶 E. coli DNA 连接酶连接酶只能催化互补粘性只能催化互补粘性末端之间的连接末端之间的连接DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。 T4 DNA 连接酶连接酶催化互补粘性末端和催化互补粘性末端和平末端之间的连接，平末端之间的连接，但平末端之间连接的但平末端之间连接的效率比较低效率比较低 。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群
5、众性治安防控工程”。 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过性末端，再通过DNADNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNADNA分子。分子。 用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点 （一）（一） 粘性末端连接粘性末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体有些限制酶只能将目的基因和载体DNADNA切割成平端，此切割成平端，此时在时在T T4 4DNADNA连接酶连接酶的作用下同样能连接起来。的作用下同样能连接起来。 质粒产生
6、平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（二）平头末端连接（二）平头末端连接“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。（三）（三） 人工接头法人工接头法 合成合成连接子连接子与与DNADNA平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割, ,产生粘性末端产生粘性末端连接，构建重组连接，构建重组DNADNA。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以
7、综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。用接头连接 用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。（四）同源多聚尾连接法（四）同源多聚尾连接法“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用
8、为重点的“群众性治安防控工程”。尾接法 DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。基因与载体的平末端连接方法有哪些？基因与载体的平末端连接方法有哪些？(1)T4DNA连接酶法连接酶法 连接平末端连接平末端DNADNA分子的方法有分子的方法有2 2种，种，一种一种是直接用是直接用T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接，连接，另一种另一种
9、是先用末端核苷酸转移酶给是先用末端核苷酸转移酶给平末端平末端DNADNA分子加上同聚物尾巴之后再用分子加上同聚物尾巴之后再用DNADNA连接酶连接酶进行连接。进行连接。T T4 4DNADNA连接酶连接酶同一般的大肠杆菌同一般的大肠杆菌DNADNA连接连接酶不同。酶不同。T T4 4DNADNA连接酶连接酶除了能够封闭具有除了能够封闭具有3-OH3-OH和和55-P-P末端的双链末端的双链DNADNA的缺口之外的缺口之外, ,在存在在存在ATPATP和加入高浓和加入高浓度酶的条件下度酶的条件下, ,它还能够连接具有完全配对碱基的平它还能够连接具有完全配对碱基的平末端末端DNADNA分子分子,
10、,但其连接效率比粘性端要低的多。但其连接效率比粘性端要低的多。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。（2） 同聚物加尾法同聚物加尾法 55特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。末端，移去几个末端核苷酸。运用运用末端核苷酰转末端核苷酰转移酶移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到体）加到DNADNA分子单链延伸末端的分子单链延伸末端的3-OH3-OH基因基因上上,
11、 ,它并不需要模板链的存在它并不需要模板链的存在, ,它一个一个加上它一个一个加上核苷酸核苷酸, ,构成由核苷酸组成的尾巴构成由核苷酸组成的尾巴, ,长度可达长度可达10100 0个核苷酸。个核苷酸。在载体中加入在载体中加入dTTPdTTP和末端核苷酸转移和末端核苷酸转移酶，在载体酶，在载体33OHOH末端延伸形成单链末端延伸形成单链PolyTPolyT尾巴。尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用将两者混合发生互补连接，缺口用DNADNA连接酶封闭。连接酶封闭。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为
12、重点的“群众性治安防控工程”。3）用化学合成的衔接物连接）用化学合成的衔接物连接 DNA DNA分子用化学合成法合成一段分子用化学合成法合成一段10101212个核苷个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过化后，通过T4DNAT4DNA连接酶，将片段分别于载体连接酶，将片段分别于载体55端和目的基因片段端和目的基因片段55连接起来。用相应的限制连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。性内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法：克隆法： TagDNATagDNA聚合酶在扩增目的基因聚合酶在扩增目的基因DNADN
13、A的同时，还能的同时，还能不依赖模版在产物不依赖模版在产物33末端加上两个游离的末端加上两个游离的A A。只。只要载体切口除人工加上的游离要载体切口除人工加上的游离T T，PCRPCR产物即可于产物即可于载体连接。载体连接。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。T-A克隆克隆T-vector两条链的两条链的5端含有一个游离的端含有一个游离的TPCR过程中，普通的过程中，普通的Taq酶可在产物的酶可在产物的3端多加一个端多加一个A“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社
14、区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒单酶切
15、点的基因连接如何降低本底和质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？防止自我环化和提高连接效率？ 目的基因片断与载体目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶由相同的单一限制性核酸内切酶（如（如EcoRI）消化酶切后）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末两者的两端均具有相同的粘性末端端, 称为单酶切点的粘性末端称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端又称全同源性粘性末端 高背景高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后载体经单一限制性核酸内切酶切割后, , 载体分子易于自载体分子易于自我环化我环化, , 既不利于目的基因的重组连接既不利于目的基因的重组连接,
16、 , 大大降低阳性克大大降低阳性克隆效率隆效率, , 又可使非重组性载体造成高背景。又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5-P 5-P以抑制以抑制DNADNA的自我环化。的自我环化。在连接反应中在连接反应中, , 具有具有5-P5-P的的目的基因目的基因DNADNA片断可有效地与去磷酸化质粒片断可有效地与去磷酸化质粒DNADNA载体通过粘载体通过粘性末端发生互补连接性末端发生互补连接, , 尽管产生的重组尽管产生的重组DNADNA分子于连接点含分子于连接点含有两个缺口的开环分子有两个
17、缺口的开环分子, ,尽管在转化时其转化效率高于线性尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环低于闭和环, , 但转化大肠杆菌后但转化大肠杆菌后, ,在菌体内其缺口可获得修在菌体内其缺口可获得修复。复。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 双向插入双向插入 经单一限制核酸内切酶（如经单一限制核酸内切酶（如EcoRIEcoRI）切割的目的基）切割的目的基因和载体因和载体, , 因二者的粘性末端是相同的因二者的粘性末端是相同的, , 因此在连接因此在连接反应中反应中, ,
18、目的基因可发生双向插入目的基因可发生双向插入, , 载体对目的基因载体对目的基因表达是有方向的表达是有方向的, , 而目的基因可双向与之相连而目的基因可双向与之相连, , 这种这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, , 若以表若以表达为目的达为目的, , 我们就要对插入的片段进行方向鉴定我们就要对插入的片段进行方向鉴定, , 因因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的转录的, , 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的不能正确转录目
19、的基因的mRNAmRNA。若构建表达若构建表达DNADNA重组体重组体选用选用双酶切切割目的基因和载体双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组体的连接发生定向连接重组, , 以便定向克隆。以便定向克隆。(YL)(YL)第六节 重组DNA导入受体细胞基因工程之基因工程之“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 在目的基因与载体连接成重组在目的基因与载体连接成重组DNADNA分子以分子以后，后，下面的重要工作主要是下面的重要工作主
20、要是将其导入受体细将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNADNA分子，分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)(cloning)。 由于外源基因与载体构成的重组由于外源基因与载体构成的重组DNADNA分子性分子性质不同、宿主细胞不同，将重组质不同、宿主细胞不同，将重组DNADNA导入宿主导入宿主细胞的具体方法也不相同。细胞的具体方法也不相同。转转重组重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安
21、全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 受体细胞：受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。导、杂交中接受外源基因的细胞。分为分为原核受体细胞原核受体细胞( (最主要是大肠杆菌最主要是大肠杆菌) )、真真核受体细胞核受体细胞 ( (最主要是酵母菌最主要是酵母菌) )、动物细胞和动物细胞和昆虫细胞昆虫细胞( (其实也是真核受体细胞其实也是真核受体细胞) )。 具有接受外源具有接受外源DNADNA的能力；为限制性内切酶的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为缺陷型菌珠或为DNADNA重组型菌珠重组型菌珠 ；在标记上和；在标记上和载体对应
22、；有利于表达；不适宜在人体或非培载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全。养条件下生存，有利于安全。受体细胞条件受体细胞条件“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。原核生物细胞是较为理想的受体细胞原核生物细胞是较为理想的受体细胞：没有细胞壁，便于外源没有细胞壁，便于外源DNA 的进入；的进入；没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNA 没有固定结合的蛋没有固定结合的蛋白质，便于外源白质，便于外源DNA与染色体与染色体DNA 重组；重组；基因组小，遗传
23、背景简单，便于外源基因基因组小，遗传背景简单，便于外源基因的遗传分析；的遗传分析；容易获得一致性的实验材料，培养简单，容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，易重复。繁殖迅速，易重复。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。表达真核生物基因存在一定的表达真核生物基因存在一定的缺陷缺陷，很多，很多真核生物基因往往不能在原核生物细胞内真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白。表达出具有生物活性的功能蛋白。需要进行需要进行适当的修饰适当的修饰“雪
24、亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下的特性外，还具有以下优点优点：基因结构相对简单，其基因表达调控机制基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工程操作；研究比较清楚，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模生产，成本低廉；培养简单，适于大规模生产，成本低廉；可以分泌表达，便于产物的提取和加工；可以分泌表达，便于产物的提取和加工；不产生毒素，是安全的受体细胞。不
25、产生毒素，是安全的受体细胞。真核生物细胞真核生物细胞-酵母受体细胞酵母受体细胞“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就是其体细胞有的特性外，最突出的优点就是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。以培养出能稳定遗传的植株或品系。不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬
26、细胞壁，不利于摄取重组坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA 分子。分子。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。动物细胞同样可以作为受体细胞。早期动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为受体细胞，近年来干细胞成为新的作为受体细胞，近年来干细胞成为新的研究热点。研究热点。原核生物细胞，大肠杆菌原核生物细胞，大肠杆菌优点：结构简单，便于操作分析优点：结构简单，便于操作分析缺点：表达蛋白可能没有活性缺点：表达蛋白可
27、能没有活性真核生物细胞，酵母真核生物细胞，酵母优点：表达蛋白加工具有活性优点：表达蛋白加工具有活性缺点：操作相对麻烦缺点：操作相对麻烦 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。 通常采用的是通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞大肠杆菌的感受态细胞，即在冰，即在冰浴中用一定浓度的浴中用一定浓度的CaClCaCl2 2处理对数生长期的大肠杆处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+Rb+、Mn2+Mn2+、K+K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)(DTT)或用氯化或用氯化
28、己胺钴处理制备感受态细胞。己胺钴处理制备感受态细胞。 感受态感受态是指受体细胞是指受体细胞能吸收外源能吸收外源DNADNA分子而有分子而有效地作为转化受体的某效地作为转化受体的某些生理状态些生理状态。一般受体细胞在对数生一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。长期转化能力最强。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1 1、直接导入法、直接导入法：（1 1）显微注射法）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。直接把目的基因注
29、入宿主细胞。（2 2）电击法：）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。打入宿主细胞。（3 3）直接吸收法）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。一起，让其吸收。（4 4）基因枪法）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。然后发射到宿主细胞中。基因导入方法基因导入方法又又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNADNA溶液，溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNADNA注射进
30、去。此注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。法常用于转基因动物的基因转移。 （1 1）微注射技术：）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法；细胞内的方法；将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。（2 2）电转化法）电转化法也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米
31、大小的微胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，孔，DNADNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。该法可用于真核细胞该法可用于真核细胞( (如动物细胞和植物细胞如动物细胞和植物细胞) )和原核细胞和原核细胞( (转化大肠杆菌和其他细菌等转化大肠杆菌和其他细菌等) )的外源的外源DNADNA的直接导入。的直接导入。 电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点 电击的处理方式对转化率有电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，着决
32、定性的作用，有两种不同有两种不同的处理方式：的处理方式：一种是较低的电一种是较低的电压，处理较长的时间（压，处理较长的时间（350V/c350V/cm 54sm 54s）；另一种是高电压，）；另一种是高电压，短时间处理（短时间处理（1 11.25kV/cm,11.25kV/cm,10s)0s)。一般常用第二种处理方一般常用第二种处理方式。式。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 利用磷酸钙利用磷酸钙-DNA-DNA共沉淀，把外源基因与共沉
33、淀，把外源基因与噬菌体噬菌体DNADNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNADNA的的能力，能力，几乎所有的双链几乎所有的双链DNADNA都可以通过这种方法导入都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬DNA-DNA-磷酸钙复合颗粒。磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外此法的转染效率远远不如体外包装法。包装法。（3）直接吸收法：）直接吸收法：“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）
34、三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。CaCa2+2+诱导诱导DNADNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：在在00的的CaclCacl2 2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时同时CaclCacl2 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。诱导大肠杆菌形成感受态。CaCa2+2+能与加入的能与加入的DNADNA分子结合，
35、形成抗分子结合，形成抗DNADNA酶酶(DNa(DNase)se)的羟基的羟基- -磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当的外表面上。当4242热刺激短暂处理细菌细胞时，热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为多间隙，为DNADNA分子提供了进入细胞的通道。分子提供了进入细胞的通道。 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。“雪亮工程是以区（县）、乡（
36、镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每g g质粒质粒DNADNA可以获得可以获得5 510106 62 2l0l07 7个转化茵落，完全可以满足个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要质粒的常规克隆的需要 MgMg2+2+对对DNADNA分子有很大的稳定性作用，分子有很大的稳定性作用，因此利用因此利用MgclMgcl2 2与与C
37、aclCacl2 2共同处理大肠杆菌细胞，共同处理大肠杆菌细胞，可以提高可以提高DNADNA的转化效的转化效率。如利用率。如利用二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)和二硫苏糖醇和二硫苏糖醇(DDT)(DDT)等进等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高效率可提高10010010001000倍，且对大小质粒分子均可进行倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。有效的转化。 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。少采用。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三
38、级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。（4 4）基因枪技术）基因枪技术又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰高速粒子轰击法击法基本原理基本原理：将：将DNADNA吸附在微型子弹吸附在微型子弹(1m)(1m)的表面通过放的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。 基本做法：基本做法：先将外源先将外源DNADNA溶液与钨、金等金属微粒溶液与钨、金等金属微粒( (直直径径0.5-5m )0.5-5m )共同保温，使共同
39、保温，使DNADNA吸附于金属颗粒表面，吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s400m/s的速度直接喷的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。基因枪转化的操作步骤n靶细胞或组织的预处理微粒子弹的制备装备基因枪n轰击n过渡培养进行筛选培养或直接分化再生植株PDS-1000 | He System“雪亮工程是以区（县）
40、、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。无宿主限制：无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。靶受体类型广泛靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速操作简单快速基因枪法转化的优点有：便携式基因枪“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治
41、中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1.体外包装转染法体外包装转染法 又称感染，将目的基因放在载体上，感染又称感染，将目的基因放在载体上，感染到要表达的细胞中到要表达的细胞中, 并在宿主菌体内扩增和表并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。达外源基因。常用的载体是质粒、常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。噬菌体、科斯质粒。 2 2、间接导入法、间接导入法“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。2.2
42、.脂质体介导法脂质体介导法 脂质体脂质体( (又叫做人工膜泡又叫做人工膜泡) )作为体内或体外输作为体内或体外输送载体的方法，送载体的方法，一般都需要将一般都需要将DNADNA或或RNARNA包囊于包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。通过融合导入细胞。 这种方法具有许多方面的优点,包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、
43、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。 1907年年Smith和和Townsent等等首先发现这种首先发现这种冠瘿瘤冠瘿瘤病病是由是由根癌农杆菌根癌农杆菌引发的。引发的。3.农杆菌的农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化质粒与植物遗传转化“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防
44、控工程”。Tumor induced by A. tumefaciens“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。农杆菌介导法转基因的基本流程农杆菌介导法转基因的基本流程生理状态生理状态来源来源植物愈伤组织的诱导植物愈伤组织的诱导农杆菌的活化农杆菌的活化愈伤组织愈伤组织 农杆菌农杆菌的共培养的共培养抗性愈伤组织抗性愈伤组织获得及植株再生获得及植株再生菌菌 种种活化状态活化状态培养基成分培养基成分缩短组培时间缩短组培时间提高再生频率提高再生频率“雪亮工程是以区（县）、乡（镇
45、）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。农杆菌的活化农杆菌的活化挑单克隆挑单克隆测测OD600收集细胞收集细胞用液体MS培养基重悬细胞“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。将预培养的外植体放入菌液中共培养将预培养的外植体放入菌液中共培养100rpm,30min取出外植体在无菌滤纸取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液上吸干菌液共培养共培养“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）
46、三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽生根，形成转化植株“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。花粉管通道法花粉管通道法 微注射法微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房 柱头滴加柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱
47、头上：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上 花粉粒携带：花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。入基因，然后授粉。 优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。 这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。思考题思考题1、获得目的基因有那些途径、获得目的基因有那些途径?2、受体细胞的选择应重点考虑那些、受体细胞的选择应重点考虑那些 因素？因素？3、酵母作为受体细胞有那些特点？、酵母作为受体细胞有那些特点？4、外源、外源DNA 转化方法有那些？转化方法有那些？“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。