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1、第六章第六章 目的基因导入受体细胞及重组子目的基因导入受体细胞及重组子的筛选的筛选第一节第一节 受体细胞受体细胞受体细胞（受体细胞（receptor cellreceptor cell）：又称宿主细胞或寄主细胞：又称宿主细胞或寄主细胞（host cellhost cell），从实验技术上讲是能摄取外源），从实验技术上讲是能摄取外源DNADNA并使其稳定并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。细胞。 随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步
2、到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。程的受体细胞。1.1.受体细胞的概念受体细胞的概念2.2.受体细胞选择所应遵循的原则受体细胞选择所应遵循的原则便于重组便于重组DNADNA分子导入。分子导入。能使重组能使重组DNADNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组缺陷型，避免其对重组DNADNA分子的降解破坏作用。）分子的降解破坏作用。）便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的受体细胞基因型）受体细
3、胞基因型）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。分泌表达。受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效
4、表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。3.3.各种类型受体细胞的优缺点各种类型受体细胞的优缺点（1 1）原核细胞）原核细胞优点优点大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNADNA的进入。的进入。没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，这为外源没有固定结合的蛋白质，这为外源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少了麻烦。重组减少了麻烦。基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源
5、基因进行遗传分析。源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。缺点缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNARNA转录后加工、修饰系转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生
6、物学活性。了表达，也不具有正常的生物学活性。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。大肠杆菌：大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。杆菌工程菌生产的。枯草杆菌：枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因表达产物分泌到培养基
7、中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培养。易于保存和培养。蓝藻：蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。的宿主。（2 2）真菌细胞）真菌细胞 真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。（3 3）植物细胞）植物细
8、胞优点：优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳定遗传的转基因植物。定遗传的转基因植物。缺点：缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。方法方法：（a a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。 （b b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。（4 4）动物细胞）动物细胞优点：优点：动物细胞具
9、有动物细胞具有RNARNA的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。易被重组质粒易被重组质粒DNADNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。转染，具有遗传稳定性和可重复性。可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。缺点：缺点： 不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。
10、第二节第二节 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1.1.重组重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞（1 1）重组质粒）重组质粒DNADNA分子转化大肠杆菌分子转化大肠杆菌转化（转化（transformation)transformation)：重组质粒重组质粒DNADNA分子通过与膜蛋白结分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。为转化。转化的方法转化的方法制备感受态细胞法制备感受态细胞法感受态细胞：处于能吸收周围环境中感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNADNA分子的生理状
11、态的细分子的生理状态的细胞。胞。制备感受态大肠杆菌一般利用制备感受态大肠杆菌一般利用CaClCaCl2 2处理。处理。电穿孔转化法电穿孔转化法 其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源DNADNA的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源DNADNA浓浓度的影响。度的影响。三亲本杂交接合转化大肠杆菌三亲本杂交接合转化大肠杆菌原理：是基于可迁移质粒的迁移作用（原理：是基于可迁移
12、质粒的迁移作用（mobilizationmobilization）而建立）而建立的一种的一种DNADNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到受体细胞。整个接合转化过程涉及到3 3种有关的细菌菌株，即种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNADN
13、A的供体菌和含有的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。转化率的计算及其影响因素转化率的计算及其影响因素转化率：转化率：DNADNA分子转化受体菌获得转化子的效率。分子转化受体菌获得转化子的效率。转化率转化率 = = 转化子数转化子数 / DNA/ DNA分子数分子数 （1010-5-5表示表示10105 5个个DNADNA分子获分子获 得一个转化子）得一个转化子）或或 转化子数转化子数 / DNA/ DNA质量（质量（10106 6/ /g g表示表示1 1 g DNAg DNA分子得分子得10106 6个转个
14、转化子）化子）辅助菌（含有结合型辅助质粒）供体菌（含有目的质粒）受体菌含有目的基因的非结合型重组质粒迁移辅助质粒转移影响转化率的因素影响转化率的因素a a：重组：重组DNADNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞的亲和性。的亲和性。b b：菌株类型：菌株类型c c：转化方法：电穿孔法最高，：转化方法：电穿孔法最高，CaClCaCl2 2诱导法居中，三亲本杂交诱导法居中，三亲本杂交接合法最低。接合法最低。（2 2）重组）重组嗜菌体嗜菌体DNADNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌转染（转染（transfectiontransfection）及
15、转导（）及转导（transductiontransduction）转染：转染：将重组将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子直接导入受体细胞中的过程称分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。为转染。转导：转导：通过通过噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNADNA分子分子转移到受体细胞内的过程。转移到受体细胞内的过程。 采用采用噬菌体噬菌体DNADNA直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对重组的重组的噬菌体噬菌体DNADNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。大肠杆菌。体外包装体外包装体外
16、包装：体外包装：在体外模拟在体外模拟噬菌体噬菌体DNADNA分子在受体细胞内发生的分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子包装成分子包装成成熟的具有感染能力的成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。噬菌体颗粒的技术。原理：原理：根据根据噬菌体噬菌体DNADNA分子体内包装的途径，分别获得缺失分子体内包装的途径，分别获得缺失D D包装蛋白的包装蛋白的噬菌体突变株和缺失噬菌体突变株和缺失E E包装蛋白的包装蛋白的噬菌体突变噬菌体突变株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，
17、都不能单独的包装包装噬菌体噬菌体DNADNA。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从中提取缺失中提取缺失D D蛋白的包装物（含蛋白的包装物（含E E蛋白）和缺失蛋白）和缺失E E蛋白的包装物蛋白的包装物（含（含D D蛋白），两者混合后就能包装蛋白），两者混合后就能包装噬菌体噬菌体DNADNA。2.2.重组重组DNADNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞 由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂，由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂，适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生
18、物。但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。（1 1）重组）重组DNADNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒-Ti-Ti质粒的质粒的T-DNAT-DNA能转移至细胞内部。因此，将外源基因与能转移至细胞内部。因此，将外源基因与TiTi质粒质粒重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植
19、物细胞中。重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。Fig. 4-16 T-DNA can integrated into the genome of plant cell多聚物介导法多聚物介导法 一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二价阳离子（价阳离子（CaCa2+2+、 MgMg2+2+、 MnMn2+2+等）于等）于DNADNA混合，能在原生质体混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。细胞内。电穿孔法电穿孔法 同原核
20、细胞的电穿孔法。同原核细胞的电穿孔法。激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性微孔，处于细胞周围的微孔，处于细胞周围的DNADNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。超声波介导转化超声波介导转化 超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外源源DNADNA进入细胞。进入细胞。基因枪法基因枪法 利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在金属颗粒表面的外源金属颗粒表面的外源DN
21、ADNA分子随之带入细胞。分子随之带入细胞。脂质体介导法脂质体介导法 脂质体（脂质体（liposomeliposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将状结构，可以将DNADNA包在其中，并通过脂质体与原生质体的融包在其中，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNADNA转运到细胞内。转运到细胞内。显微注射法显微注射法 显微注射法显微注射法是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源DNADNA直接注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主直接
22、注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。花粉管通道法花粉管通道法 此法是将外源此法是将外源DNADNA涂于授粉的枝头上，使涂于授粉的枝头上，使DNADNA沿花粉管通道或沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。子及早期的胚胎细胞。3.3.重组重组DNADNA分子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞
23、 哺乳动物的细胞很难捕获外源哺乳动物的细胞很难捕获外源DNADNA，这明显影响了哺乳动物，这明显影响了哺乳动物基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外源源DNADNA导入哺乳动物细胞的方法。导入哺乳动物细胞的方法。病毒颗粒转导法病毒颗粒转导法磷酸钙转染法磷酸钙转染法 哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-DNA-磷酸钙沉淀物，磷酸钙沉淀物，使使DNADNA转入细胞。转入细胞。DEAE-DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法 二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能二乙胺乙基葡聚
24、糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源促进哺乳动物细胞捕获外源DNADNA，实现短时间的有效表达。，实现短时间的有效表达。聚阳离子聚阳离子-DMSO-DMSO转染法转染法 此方法采用聚阳离子此方法采用聚阳离子poly-brenepoly-brene处理哺乳动物细胞，增加细处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对胞表面对DNADNA的吸附能力，然后再用的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO25%-30%DMSO短暂处理细胞，短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对增加膜的通透性，提高对DNADNA的捕获量。的捕获量。显微注射转基因技术显微注射转基因技术电穿孔电穿孔DNADNA转移
25、技术转移技术脂质体介导法脂质体介导法活化菌种，扩大培养，使其活化菌种，扩大培养，使其处 于 对 数 生 长 后 期处 于 对 数 生 长 后 期（OD600=0.4）3-4 ml菌液冰水浴中菌液冰水浴中10分钟，分钟，4 离心集菌离心集菌菌 体 悬 浮 于 含菌 体 悬 浮 于 含CaCl2的预冷缓的预冷缓冲液中，冰水浴冲液中，冰水浴15min， 4 离离心集菌，弃上清，心集菌，弃上清，沉 淀 物 重 悬 于沉 淀 物 重 悬 于CaCl2的预冷缓的预冷缓冲液中，冲液中，4 下下放置放置12-14 h0.2 ml新制备好新制备好的感受细胞中加的感受细胞中加入缓冲液溶解的入缓冲液溶解的重组重组D
26、NA，置于，置于冰水浴中冰水浴中1 h以以上，期间轻摇几上，期间轻摇几次次转入转入42 水浴水浴上上2 min，使，使感受态细胞吸感受态细胞吸收重组收重组DNA。转入转入37 水浴水浴上上5 min， 加入加入1 ml不含选择性不含选择性药物的药物的LB培养培养基基筛选转化子筛选转化子37 震荡培养震荡培养30-60 min铺板培养铺板培养图图6.1 6.1 感受态细胞的制备及转化感受态细胞的制备及转化图图6.2 6.2 电穿孔仪及电击杯电穿孔仪及电击杯图图6.2 6.2 噬菌体的体外包装噬菌体的体外包装图图6.3 6.3 脂质体转染法脂质体转染法1 1、传代细胞准备：细胞在转染前、传代细胞准
27、备：细胞在转染前2424传代传代, ,待细胞密度达待细胞密度达50%50%60%60%满底时即可进行满底时即可进行转染。加入沉淀前转染。加入沉淀前3 34h4h，用，用9ml9ml完全培养液培养细胞。完全培养液培养细胞。2 2、DNADNA沉淀液的准备：首先将质粒沉淀液的准备：首先将质粒DNADNA用乙醇沉淀（用乙醇沉淀（101050g/10cm50g/10cm平板），空气平板），空气中晾干沉淀，将中晾干沉淀，将DNADNA沉淀重悬于沉淀重悬于5L5L无菌水中，加无菌水中，加50L 2.5mol/L CaCl50L 2.5mol/L CaCl2 2。3 3、用巴斯德吸管在、用巴斯德吸管在500
28、L500L2 2HeBSHeBS中逐滴加入中逐滴加入DNA-CaClDNA-CaCl2 2溶液，同时用另一吸管溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至吹打溶液，直至DNA-CaClDNA-CaCl2 2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1 12min2min。4 4、室温静置、室温静置30min,30min,出现细小颗粒沉淀。出现细小颗粒沉淀。5 5、将沉淀逐滴均匀加入、将沉淀逐滴均匀加入10cm10cm平板中，轻轻晃动。平板中，轻轻晃动。6 6、在标准生长条件下培养细胞、在标准生长条件下培养细胞4 416h16h。除去培养液，用。除去培养液，用5ml5
29、ml1 1HeBSHeBS洗细胞洗细胞2 2次，次，加入加入10ml10ml完全培养液培养细胞。完全培养液培养细胞。7 7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。收集细胞或分入培养皿中选择培养。第三节第三节 重组子的筛选重组子的筛选 在重组在重组DNADNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组体细胞都能被导入重组DNADNA分子，一般仅有少数重组分子，一般仅有少数重组DNADNA分子能分子能进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的有我们期待的DNADNA
30、分子外，另外一些还可能是由于载体自身或分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源一个载体与多个外源DNADNA片段形成的非期待重组片段形成的非期待重组DNADNA分子导入所分子导入所致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。筛选出来。转化子：转化子：导入外源导入外源DNADNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。化子。重组子：重组子：含有重组含有重组DNADNA分子的转化子称为重组子。分子的转化子称为重组子。阳性克隆子（期望重组子）：阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的
31、基因的重组子称含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。为阳性克隆子或期望重组子。筛选（选择）：筛选（选择）：经过各种方法将外源经过各种方法将外源DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。1.1.遗传表型直接筛选法遗传表型直接筛选法 在构建基因工程载体时，载体在构建基因工程载体时，载体DNADNA分子上通常携带了一定的分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可进
32、行转化子或重组子的初出特殊的表型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。步筛选。 一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在布在选择培养基选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，观上，在最适生长温度条件下培养一段时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。察菌落生长情况，即可挑选出转化子。抗药性筛选抗药性筛选 氨苄青霉素（氨苄青霉素（AmpAmp）、氯霉素（）、氯霉素（CmpCmp）、卡那霉素（）、卡那霉素（KanKan）、）、四环素（四环素（TetTet）、链霉素（）、链霉素（StrStr） 主要用于重组质粒主
33、要用于重组质粒DNADNA分子的转化子的筛选。在含相应抗生分子的转化子的筛选。在含相应抗生素的培养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质粒的素的培养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质粒的受体菌不能存活。受体菌不能存活。插入失活筛选法插入失活筛选法 外源外源DNADNA的插入特定载体后导致遗传标记基因失活，借此筛的插入特定载体后导致遗传标记基因失活，借此筛选重组子。选重组子。插入表达筛选法插入表达筛选法 与插入失活策略向相反，插入表达法是利用外源与插入失活策略向相反，插入表达法是利用外源DNADNA插入特插入特定载体后导致遗传标记基因表达，借此筛选重组子。定载体后导致遗传标记基因表达
34、，借此筛选重组子。显色互补筛选法显色互补筛选法 LacZLacZ基因的蓝白斑筛选基因的蓝白斑筛选形成嗜菌斑筛选法形成嗜菌斑筛选法 对于对于DNADNA载体系统，只有在外源载体系统，只有在外源DNADNA插入载体后，重组的插入载体后，重组的DNADNA分子大小在野生型分子大小在野生型DNADNA分子的分子的7878%-105%-105%范围内时，才能范围内时，才能在体外包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。后者在转导受体菌在体外包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。后者在转导受体菌后，转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常后，转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分
35、。生长，两者很容易区分。2.DNA2.DNA电泳检测法电泳检测法直接电泳检测法直接电泳检测法 重组的质粒重组的质粒DNADNA分子由于有外源分子由于有外源DNADNA的插入，比未插入外源的插入，比未插入外源DNADNA的质粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。的质粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。酶切电泳筛选法酶切电泳筛选法 通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源DNADNA不不一定是目的一定是目的DNADNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来
36、。再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来。PCRPCR检测法检测法 外源外源DNADNA的两侧序列多为已知序列，通过的两侧序列多为已知序列，通过PCRPCR扩增外源扩增外源DNADNA，然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。3.3.核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法4.4.免疫化学检测法免疫化学检测法 基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非体探针，而非DNADNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提条件是克隆基因可在宿主细胞
37、内表达，并且有目的蛋白的抗体。条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。放射性抗体检测法放射性抗体检测法免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法酶联免疫检测法（酶联免疫检测法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶合第二抗体，然后与目的蛋白抗原合第二抗体，然后与目的蛋白抗原- -抗体复合物结合，通过检抗体复合物结合，通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。5.5.转译筛选法转译筛选法 转译筛选法是
38、通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。杂交抑制转译杂交抑制转译要求：要求：被研究的目的基因编码有丰富的被研究的目的基因编码有丰富的mRNA mRNA 。原理：原理： DNADNA蛋白质蛋白质mRNAmRNA蛋白质蛋白质杂交转化菌落转化菌落提取重组提取重组DNA与总与总mRNA杂交杂交形成形成DNA-RNA杂种分子杂种分子将总将总mRNA（包括（包括DNA-RNA分子）提取出来分子）提取出来体外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影总总mRNA体
39、外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影经对比，（经对比，（1）比（）比（2）中少了一种蛋白质中少了一种蛋白质找到一种转译作用被找到一种转译作用被抑制了的抑制了的mRNA 筛选出重组菌落（或筛选出重组菌落（或噬菌斑）噬菌斑） 步骤：步骤：（1 1）（2 2）（3 3）杂交选择转译杂交选择转译重组体库重组体库提取提取DNA固定在固定在NC膜上膜上与与mRNA或总或总RNA杂交杂交目的基因与对应的目的基因与对应的mRNA杂杂交，交，mRNA固定在固定在NC膜上膜上将分离的将分离的mRNA进行体外转译进行体外转译凝胶电泳或生物活性检测凝胶电泳或生物活性检测找出单菌落重组体找出单菌落重组体6
40、.DNA-6.DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法原理：原理：外源外源DNADNA蛋白质蛋白质能与某一能与某一特定特定DNADNA序列结合序列结合作为探针与克隆群体杂交作为探针与克隆群体杂交翻译翻译克隆载体克隆载体+外源外源DNA受体细胞受体细胞导入导入转化子转化子非转化子非转化子含有克隆载体或外源DNA不含有克隆载体或外源DNA重组子重组子非重组子非重组子仅含有克隆载体含有克隆载体+外源DNA阳性克隆子阳性克隆子含有外源目的DNA非阳性克隆子非阳性克隆子含有外源其他DNA图图6.4 6.4 转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞滤膜（固定抗体）+图图6.5 6.5 放射性抗体检测法放射性抗体检测法图图6.6 6.6 放射性抗体检测法放射性抗体检测法加入目的基因产物的标记抗体转化菌落不含有目的基因含有目的基因涂板培养抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素图图6.7 6.7 免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法