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1、实验三 革兰染色法,实验目的和要求,1. 理解革兰染色法的原理； 2. 掌握细菌涂片的制作； 3.掌握革兰染色的方法以及意义；,细菌形态检查方法,1. 不染色标本检查法 2. 染色标本检查法,（一）不染色标本检查,应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法,压滴法,悬滴法,镜 检,观察细菌的形态、大小和排列，还能鉴别细菌。,（二）染色标本检查法,细菌体积小、半透明，经染色后才能观察清楚。 染色法是染色剂与细菌细胞质结合。最常用的染色剂是盐类。 碱性染色剂是由有色的阳离子和无色的阴离子组成；酸性染色剂则相反。细菌细胞质富含核酸，可以与带正电荷的碱性染色剂结合；
2、酸性染料不能使菌体染色，而使背景着色而形成反差，故称负染。,染色标本的检查法,负染色法,正染色法,细菌染色的方法,单染法:采用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴别。 复染法（鉴别染色法）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。,革兰染色法,该染色法是最常用最重要的染色法。是丹麦细菌学家革兰于1884年创建的，至今仍广泛应用。,革兰染色法的原理,渗透学说：与肽聚糖结构有关。 革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，酒精易渗透进入细
3、胞内，将结合的结晶紫碘复合物脱出。 化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。 等电点学说：与细菌所带电荷有关。 革兰阳性菌等电点低（pI）为23，在中性或碱性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌pI为45，所带负电荷少，影响结合染色的多少。,实验材料与方法,（一）材料: 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物 染液：结晶紫染液、卢戈碘液 95%酒清、稀释复红 其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等 （二）方法： 细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定 革兰染色：初染、媒染、脱色、复染 油镜使用：观察染色结果并记录,
4、染色标本检查的基本程序,涂片干燥固定染色 涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布 干燥：自然干燥、热空气干燥 固定：通过火焰外焰三次 染色：初染、媒染、脱色、复染,细菌涂片的制作,革兰染色法（Gram染色）,染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液 95乙醇、稀释复红 染色方法：,结晶紫 初染,卢戈碘液 媒染,95乙醇 脱色,稀释复红 复染,1分钟,1分钟,影响革兰染色的关键步骤是脱色,水洗,水洗,水洗,水洗,干燥,30S1min,Procedures of Gram Staining,初染,媒染,脱色,复染,结晶紫1分钟,卢戈氏碘液1分钟,95%酒精30秒,稀释复红30秒,革兰染色结果,紫色革兰阳性菌,红色革兰阴性菌,革兰染色意义,有助于鉴别细菌 有助于选择用药 有助于了解细菌的致病性,影响革兰染色的因素,1. 操作因素 涂片的厚薄 脱色时间的长短 2. 染液因素 卢戈碘液放置时间过长 95乙醇挥发 结晶紫与草酸铵混合时间太长 3. 细菌因素： 细菌种类 细菌菌龄,