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1、实验三实验三 革兰染色法革兰染色法实验目的和要求实验目的和要求|理解革兰染色法的原理；理解革兰染色法的原理；|掌握细菌涂片的制作；掌握细菌涂片的制作；|掌握革兰染色的方法以及意义；掌握革兰染色的方法以及意义；细菌形态检查方法细菌形态检查方法|不染色标本检查法不染色标本检查法|染色标本检查法染色标本检查法（一）不染色标本检查（一）不染色标本检查|应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式|常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法压滴法压滴法载玻片载玻片细菌悬液细菌悬液盖玻片盖玻片悬滴法悬滴法镜镜镜镜 检检检检观察细菌的形态、大小和排列，还能鉴别细菌。观察细菌的形态、大小和排列，还能鉴别细菌。（二）染色
2、标本检查法（二）染色标本检查法|细菌体积小、半透明，经染色后才能观察清楚。|染色法是染色剂与细菌细胞质结合。最常用的染色剂是盐类。|碱性染色剂是由有色的阳离子和无色的阴离子组成；酸性染色剂则相反。细菌细胞质富含核酸，可以与带正电荷的碱性染色剂结合；酸性染料不能使菌体染色，而使背景着色而形成反差，故称负染。染色标本的检查法染色标本的检查法负染色法负染色法正染色法正染色法大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流细菌染色的方法细菌染色的方法|单染法单染法:采用一种染料染色采用一种染料染色,只能观察细菌
3、只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴别。特性和进行鉴别。|复染法（鉴别染色法）复染法（鉴别染色法）:采用两种或两种以采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。不同的颜色，以便鉴别细菌。革兰染色法革兰染色法|该染色法是最常用最重要的染色法。是丹该染色法是最常用最重要的染色法。是丹麦细菌学家革兰于麦细菌学家革兰于1884年创建的，至今仍年创建的，至今仍广泛应用。广泛应用。革兰染色法的原理革兰染色法
4、的原理渗透学说：与渗透学说：与渗透学说：与渗透学说：与肽聚糖结构肽聚糖结构肽聚糖结构肽聚糖结构有关。有关。有关。有关。革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物酒精易渗透进入细胞内，将结
5、合的结晶紫碘复合物酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物脱出。脱出。脱出。脱出。化学学说：与细菌细胞质中化学学说：与细菌细胞质中化学学说：与细菌细胞质中化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐有关。有关。有关。有关。革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结碘结碘结碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。等电点学说：与细菌等电点
6、学说：与细菌等电点学说：与细菌等电点学说：与细菌所带电荷所带电荷所带电荷所带电荷有关。有关。有关。有关。革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（pIpIpIpI）为）为）为）为23232323，在中性或碱，在中性或碱，在中性或碱，在中性或碱性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌pIpIpIpI为为为为45454545，所带，所带，所带，所带负电荷少，影响结合染色的多少。负电荷少，影响结合染色的多少。负电荷少，影响结合染色的多少。负电荷少，影响结合染色的多少。实验材料
7、与方法实验材料与方法|材料材料材料材料:菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物 染液：结晶紫染液、卢戈碘液染液：结晶紫染液、卢戈碘液染液：结晶紫染液、卢戈碘液染液：结晶紫染液、卢戈碘液 95%95%酒清、稀释复红酒清、稀释复红酒清、稀释复红酒清、稀释复红 其他：玻片、接种环、酒精灯其他：玻片、接种环、酒精灯其他：玻片、接种环、酒精灯其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等|方法：方法：方法：方法：细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定细
8、菌涂片的制作：涂片、干燥、固定细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定 革兰染色：初染、媒染、脱色、复染革兰染色：初染、媒染、脱色、复染革兰染色：初染、媒染、脱色、复染革兰染色：初染、媒染、脱色、复染 油镜使用：观察染色结果并记录油镜使用：观察染色结果并记录油镜使用：观察染色结果并记录油镜使用：观察染色结果并记录染色标本检查的基本程序染色标本检查的基本程序|涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布干燥：自然干燥、热空气干燥干燥：自然干燥、热空气干燥固定：通过火焰外焰三次固定：通过火焰外焰三次染色：初染、媒染
9、、脱色、复染染色：初染、媒染、脱色、复染细细菌菌涂涂片片的的制制作作涂片涂片涂片涂片干燥干燥干燥干燥固定固定固定固定染色染色染色染色镜检镜检镜检镜检革兰染色法（革兰染色法（Gram染色）染色）|染液组成：染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液结晶紫染液、卢戈碘液 9595乙醇、稀释复红乙醇、稀释复红|染色方法：染色方法：结晶紫结晶紫结晶紫结晶紫 初染初染初染初染卢戈碘液卢戈碘液卢戈碘液卢戈碘液 媒染媒染媒染媒染95959595乙醇乙醇乙醇乙醇 脱色脱色脱色脱色稀释复红稀释复红稀释复红稀释复红 复染复染复染复染1 1 1 1分钟分钟分钟分钟30S30S30S30S1min1min1min1min1 1
10、1 1分钟分钟分钟分钟影响革兰染色的关键步骤是脱色影响革兰染色的关键步骤是脱色水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗水洗干燥干燥干燥干燥30S30S30S30S1min1min1min1min Procedures of Gram Staining初染初染初染初染媒染媒染媒染媒染脱色脱色脱色脱色复染复染复染复染结晶紫结晶紫结晶紫结晶紫1 1 1 1分钟分钟分钟分钟卢戈氏碘液卢戈氏碘液卢戈氏碘液卢戈氏碘液1 1 1 1分钟分钟分钟分钟95%95%95%95%酒精酒精酒精酒精30303030秒秒秒秒稀释复红稀释复红稀释复红稀释复红30303030秒秒秒秒革兰染色结果革兰染色结果|紫色革兰阳性菌|红色革兰阴性菌革兰染色意义革兰染色意义|有助于鉴别细菌有助于鉴别细菌|有助于选择用药有助于选择用药|有助于了解细菌的致病性有助于了解细菌的致病性影响革兰染色的因素影响革兰染色的因素|操作因素操作因素 涂片的厚薄涂片的厚薄 脱色时间的长短脱色时间的长短|染液因素染液因素 卢戈碘液放置时间过长卢戈碘液放置时间过长 9595乙醇挥发乙醇挥发 结晶紫与草酸铵混合时间太长结晶紫与草酸铵混合时间太长|细菌因素：细菌因素：细菌种类细菌种类 细菌菌龄细菌菌龄|完成实验报告一份。完成实验报告一份。