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1、关于实验四细菌的革兰染色法现在学习的是第1页，共13页一、实验目的一、实验目的1、了解革兰染色的原理。2、掌握革兰染色的方法。3、掌握细菌的基本形态和结构。现在学习的是第2页，共13页二、试验原理细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂（番红）染色，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂（番红）染色，如果细菌不被脱色而保持原来染料的蓝紫色者，如果细菌不被脱色而保持原来染料的蓝紫色者，为革兰氏阳性菌；如果被脱色，而被染上复染剂为革兰氏阳性菌；如果被脱色，而被染上复染剂的红色者则为革兰氏阴性菌。的红色者则为革兰氏阴性菌。现在学习的是
2、第3页，共13页革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因G+G+菌细胞壁结构致密菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚肽聚糖层厚)，且脂质含量少，且脂质含量少，且脂质含量少，且脂质含量少，乙醇不易渗入乙醇不易渗入乙醇不易渗入乙醇不易渗入脱色脱色脱色脱色。G-菌细胞壁结构疏松菌细胞壁结构疏松菌细胞壁结构疏松菌细胞壁结构疏松(肽聚糖层薄肽聚糖层薄肽聚糖层薄肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。，且脂质含量多，乙醇溶解脂质
3、后易渗入细胞而脱色。，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。G+G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。G-菌菌体菌菌体菌菌体菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。G+G+菌等电点比菌等电点比菌等电点比菌
4、等电点比G-G-菌低，在同一菌低，在同一菌低，在同一菌低，在同一pHpH值条件下阳性菌比阴值条件下阳性菌比阴值条件下阳性菌比阴值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料(结晶结晶紫紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。结合牢固，不易被乙醇脱色。结合牢固，不易被乙醇脱色。结合牢固，不易被乙醇脱色。现在学习的是第4页，共13页三、试验材料三、试验材料显微镜、酒精灯、火柴、牙签、载玻片、吸水显微镜、酒精灯、火柴、牙签、载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理盐水
5、、蒸纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理盐水、蒸馏水馏水草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（Lugol）碘液、）碘液、95%乙醇、蕃红红染液乙醇、蕃红红染液口腔中的细菌口腔中的细菌现在学习的是第5页，共13页四、操作步骤四、操作步骤1、标本片制备取载玻片取载玻片1块，加块，加1滴生理盐水。用牙签滴生理盐水。用牙签小心轻刮自己舌苔几下，盐水中混匀涂成一薄层。小心轻刮自己舌苔几下，盐水中混匀涂成一薄层。在室温下自然干燥。在室温下自然干燥。用片夹夹住玻片通过火焰用片夹夹住玻片通过火焰3次固定标本，次固定标本，自然冷却。自然冷却。现在学习的是第6页，共13页2、染色、染色初染：初染：在
6、固定好并已冷却的涂片标本上滴加在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满涂膜。约结晶紫染液，要盖满涂膜。约1 1分钟后，用细水流从分钟后，用细水流从分钟后，用细水流从分钟后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。玻片的一端把游离的染液洗去。玻片的一端把游离的染液洗去。玻片的一端把游离的染液洗去。媒染（增加染料与细胞的亲和力）：媒染（增加染料与细胞的亲和力）：媒染（增加染料与细胞的亲和力）：媒染（增加染料与细胞的亲和力）：滴加卢戈碘滴加卢戈碘滴加卢戈碘滴加卢戈碘液数滴，作用液数滴，作用液数滴，作用液数滴，作用1 1分钟后，轻轻水洗。分钟后，轻轻水洗。分钟后，轻轻水洗。分钟后，轻轻水洗。脱
7、色：脱色：脱色：脱色：在玻片上加在玻片上加在玻片上加在玻片上加95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇2323滴，并轻轻转滴，并轻轻转滴，并轻轻转滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。复染：复染：复染：复染：滴加稀释复红染液数滴，作用滴加稀释复红染液数滴
8、，作用滴加稀释复红染液数滴，作用滴加稀释复红染液数滴，作用1212分钟分钟后流水冲洗。后流水冲洗。现在学习的是第7页，共13页3、结果判定、结果判定染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体的形滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体的形态、大小、排列和染色。态、大小、排列和染色。现在学习的是第8页，共13页五、注意事项1、决定革兰染色成败的关键是脱色程度。、决定革兰染色成败的关键是脱色程度。若脱色过度，即使是若脱色过度，即使是若脱色过度，即使是若脱色过度，即使是G+菌，其蓝紫色也会被脱去而染菌，其蓝紫色也会被脱去而染上红色，被误认
9、为是上红色，被误认为是G-G-菌（假阴性）。若脱色不足，菌（假阴性）。若脱色不足，菌（假阴性）。若脱色不足，菌（假阴性）。若脱色不足，即使即使即使即使G-G-菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为G+G+菌菌(假阳性假阳性假阳性假阳性)。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响
10、，脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已知无法严格规定。一般可用已知无法严格规定。一般可用已知无法严格规定。一般可用已知G+G+菌和菌和菌和菌和G-G-菌作练习，以菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰反应时，掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰反应时，应同时另作一张已知应同时另作一张已知G+菌和菌和菌和菌和G-G-菌的混合涂片，以资对菌的混合涂片，以资对菌的混合涂片，以资对菌的混合涂片，以资对照。照。照。照。现在学习的是第9页，共13页五、注意事项五、注意事项2、涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。
11、、涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳(阴阴阴阴)性。镜检时，性。镜检时，性。镜检时，性。镜检时，要以分散开的细菌着色为准。要以分散开的细菌着色为准。要以分散开的细菌着色为准。要以分散开的细菌着色为准。3 3、做革兰染色的菌种，以培养、做革兰染色的菌种，以培养1824h1824h为宜。为宜。为宜。为宜。一般情况下一般情况下一般情况下一般情况下G-G-菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影响；菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影响；菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影
12、响；菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影响；而而而而G+G+菌菌菌菌,有的在幼龄时呈阳性，培养有的在幼龄时呈阳性，培养有的在幼龄时呈阳性，培养有的在幼龄时呈阳性，培养2424和和和和48h48h以上，由于细胞以上，由于细胞以上，由于细胞以上，由于细胞老化或死亡也可变为阴性反应。老化或死亡也可变为阴性反应。老化或死亡也可变为阴性反应。老化或死亡也可变为阴性反应。4 4、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的作用。作用。作用。作用。现在学习的是第10页，共1
13、3页六、作业绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况。绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况。绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况。绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况。革兰染色结果记录革兰染色结果记录革兰染色结果记录革兰染色结果记录现在学习的是第11页，共13页七、思考题1、试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁结、试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁结构的特征？构的特征？2、革兰染色有什么实际意义？、革兰染色有什么实际意义？3、当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎、当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？现在学习的是第12页，共13页感谢大家观看现在学习的是第13页，共13页