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1、实验十三 经典免疫技术,实验目的要求,1、掌握直接凝集反应、沉淀反应的原理和操作方法 2、熟悉斑点免疫层析试验的原理和操作方法,一、凝集反应,为一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。,（一）实验原理,直接凝集反应（原理）,颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。 （1）玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。可用以菌型、ABO血型等的鉴定。 （2）试管法是一
2、种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。诊断伤寒、副伤寒病的肥达反应均属定量凝集反应。,Y,Y,Y,+,Y,Y,Y,（二）材 料,标准抗A、抗B诊断血清；受测者红细胞、盐水、采血针、棉球、玻片等。 待测细菌纯培养物，标准诊断血清,（三）方 法1、直接凝集反应测血型,（1）取一块清洁玻片，用记号笔划上记号，左上角写A字，右上角写B字。 （2）用小滴管吸A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸B型标准血清（抗A）一滴加入右侧。 （3）穿刺手指取血，玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支
3、牙签，切勿混用。 （4）静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。 注意事项： （1）采血时要尽量避免用力挤压手指或耳垂，以免发生溶血影响结果。 （2）如肉眼观察难以辨认，可使用显微镜观察凝血现象。,操作流程,2、直接凝集反应细菌菌型测定,（1）取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，在一侧滴加标准的诊断血清一滴,另一侧滴加一滴生理盐水。 （2）用接种环无菌操作取适量的待测细菌,分别与标准诊断血清和生理盐水混均。 （3）静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。 注意事项： （1）生理盐水、诊断血清要适量； （2）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放入消毒缸
4、内； （3）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则影响结果观察。,（四）结果判断,二 、沉淀反应（双向琼脂扩散试验）,又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。 将可溶性抗原和相应的抗体加入到琼脂板上对应的孔后,两者各自向四周扩散,当浓度比例合适,则经一定时间后,在加有抗原和抗体的两孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。 沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀线。 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。,（一）实验原理,（二）材
5、料,玻片、琼脂糖、抗原、抗体（0；1:2； 1:4； 1:8； 1:16）、微量加样器、滴管、湿盒、水浴箱等。,（三） 操作步骤,1.制板：将溶化的1.5%琼脂3.5-4ml倒在载玻片上，使之能将表面覆盖，制成厚度约23mm厚的琼脂糖凝胶板。 2.打孔:待冷却后根据所需形状打孔,孔径为4mm。孔间距离为4mm-5mm;琼脂玻板的制备梅花型打孔图。 3.加样:用微量加样器取Ag10uL加入中央孔;将抗体进行倍比稀释,稀释度分别为, 1:1（原液）；1:2;1:4;1:8;1:16,每个稀释度取10uL加入外围抗体孔中。 4.扩散: 置湿盒37, 24小时观察结果,每孔加入 抗原/抗体10l,注意
6、事项 （1）打孔时，不要将琼脂划破； （2）加样时，不要溢出孔外； （3）加样用的吸管不要混用。,Ag,0,1/1,1/2,1/4,1/8,1/16,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,（四） 结果记录,三、胶体金标记技术,用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未知抗原或抗体的技术。 （一）原理 以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物的显色（20nm的胶体金颗粒呈砖红色）达到检测目的。 根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤试验和胶体金斑点免疫层析试验。,胶体金斑点免疫层析试验,将各种反应试剂(
7、抗体)附着在硝酸纤维素膜条上，检测时将待检标本加在膜条的一端，使膜条上的胶体金标记抗体溶解后，与标本中的待测物质反应形成IC，并通过毛细管作用在膜条上渗滤、移行，再与膜上另一种抗体反应，再后被截留、聚集在膜条的一定区域，形成有颜色的反应条带。,用鼠抗-HCG单克隆抗体（测试区T区）和兔抗鼠1gG多克隆抗体（参照区C区）分别固相硝酸纤维膜和胶体金标记的抗-HCG单克隆抗体（吸水区）及其他试剂制成，应用层析式双抗体夹心法的原理检测尿液中HCG，用于妊娠早期辅助诊断。,临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂条,（二）材料,待检尿液、早早孕试验条,（三）方法,将早早孕试验棒的吸水区浸入待检尿液中35秒，勿超
8、过“max”线 取出试验条放置于干燥、不吸水的平面上，置45秒后观察结果,阳性,阴性,无效,HCG(+) HCG(-),结论:,（四）实验结果(3种可能),（五）结果分析,人绒毛膜促性腺激素（HCG）是受孕妇女体内产生的一种糖蛋白类激素，在受孕妇女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第6天开始分泌HCG，一般11天后可以测出,早期妊娠时HCG的分泌量增加很快，约1.7-2天增加一倍,而正常非怀孕妇女尿液检测不到HCG。所以，检测尿液中HCG是判定妊娠的可靠指标。,C区,T区,吸水区,抗小鼠IgG抗体(固定),抗-HCG抗体(固定),胶体金-抗 -HCG (小鼠IgG,游离),下端浸入尿液,试纸条,HCG,虹吸作用HCG上行与吸水区的金标抗体结合,并上行至T区,HCG又与抗-HCG抗体结合-双抗体夹心法,C区,T区,抗-HCG + HCG + 胶体金-抗-HCG,T区红线,C区红线,抗小鼠IgG + 胶体金-抗-HCG,