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1、免疫学实验技术免疫学实验技术浙江大学医学院利用免疫学原理来检测抗原、多种免疫分子(抗体、补体、细胞因子和粘附分子等)及免疫细胞的实验过程。有助于疾病的辅助诊断、治疗及预后判断。一、一、凝集反应凝集反应 颗粒性抗原（细胞、细菌等）或吸附于免疫无颗粒性抗原（细胞、细菌等）或吸附于免疫无关载体上的可溶性抗原与相应抗体，在适量电解质关载体上的可溶性抗原与相应抗体，在适量电解质的存在下，形成肉眼可见的凝集团块。的存在下，形成肉眼可见的凝集团块。1、直接凝集反应 （1 1）玻片凝集试验）玻片凝集试验 ABOABO血型鉴定血型鉴定 （2 2）试管凝集试验）试管凝集试验 肥达试验肥达试验效价（滴度）：以出现明
2、显抗原抗体反应现象的以出现明显抗原抗体反应现象的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的含量。最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的含量。凝集反应（凝集反应（agglutination)颗粒型抗原颗粒型抗原细菌、细胞细菌、细胞抗体抗体（凝集素）（凝集素）电解质电解质（生理盐水）（生理盐水）3750数小时数小时凝集反应（凝集成团）凝集反应（凝集成团）1.直接凝集试验直接凝集试验玻片法玻片法试管法试管法含有已知抗体含有已知抗体的诊断血清的诊断血清待检菌液待检菌液生理盐水生理盐水特点简便、快速简便、快速不能定量不能定量UUUU待检血清盐水简便、快速简便、快速能定量能定量肥达氏试验（肥达氏试验（widal te
3、st)伤寒、副伤寒伤寒、副伤寒已知抗原ABO血型鉴定红细胞表面抗原 抗A抗体 抗B抗体 血型 A +-A B -+B H -O A,B +AB 2、间接凝集反应 指可溶性抗原(或抗体)吸附在乳胶颗粒或红细胞等载体表面与相应抗体(或抗原)结合反应，在适宜的条件下，出现凝集现象。正向间接凝集反应 用可溶性抗原包被载体以检测抗体。反向间接凝集反应 用抗体包被载体以检测抗原。二、沉淀反应二、沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合，当两者比例合适，并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。沉淀试验（沉淀试验（precipitation test）可溶性抗原可溶性抗原细胞裂解液细胞裂解液抗体抗体（沉
4、淀素）（沉淀素）电解质电解质（生理盐水）（生理盐水）3750数小时数小时沉淀反应（沉淀反应（清澄液中出现混浊沉淀清澄液中出现混浊沉淀）沉淀反应分类（1 1）琼脂扩散试验）琼脂扩散试验 a.a.单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 b.b.双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验（2 2）免疫电泳试验）免疫电泳试验 对流免疫电泳：原理：在阴极孔内加抗原，阳对流免疫电泳：原理：在阴极孔内加抗原，阳极孔内加抗体。通电后，抗原带负电荷较多，分子极孔内加抗体。通电后，抗原带负电荷较多，分子较小，向阳极泳动；抗体分子带负电荷较少，加上较小，向阳极泳动；抗体分子带负电荷较少，加上分子量大，在琼脂的电渗作用下向阴极泳动。
5、分子量大，在琼脂的电渗作用下向阴极泳动。（3 3）环状沉淀试验）环状沉淀试验 （1）单向扩散试验）单向扩散试验（Single redial diffusion test）预先混有抗体（2）双向扩散试验）双向扩散试验（Double diffusion test）（3）对流免疫电泳）对流免疫电泳作用及特点：作用及特点：抗体球蛋白移向阴极，抗原分子移向阳极，当两抗体球蛋白移向阴极，抗原分子移向阳极，当两者在适当比例处相遇，即形成灰白色沉淀线。者在适当比例处相遇，即形成灰白色沉淀线。检查乙型肝炎抗原及甲胎蛋白，敏感度比双向扩检查乙型肝炎抗原及甲胎蛋白，敏感度比双向扩散法高约散法高约10倍，只需倍，只需
6、12小时即可获得检验结果。小时即可获得检验结果。不能定量测定。不能定量测定。AgAb_+三、三、免疫标记技术免疫标记技术 原理：利用酶、荧光素、胶体金、发光物质以及放射性核素等标记物来标记抗原或抗体，再与标本中的抗体或抗原反应，最后测定复合物中的标记物。优点：特异、敏感、快速，可作定性、定量或定位测定。依据检测物分两类：依据检测物分两类：1.1.免疫组化技术免疫组化技术免疫组化技术免疫组化技术(immunohistochemical (immunohistochemical technique)technique)，用于组织，用于组织/细胞中抗原或抗体的定位；细胞中抗原或抗体的定位；2.2.免
7、疫测定免疫测定免疫测定免疫测定(immunoassay)(immunoassay)，用于液体标本中抗原，用于液体标本中抗原或抗体的检测。或抗体的检测。依据标记物的不同，可分为：依据标记物的不同，可分为：酶免疫技术、荧光免疫技术、金免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术和放射免疫技术。化学发光免疫技术和放射免疫技术。1、酶免疫技术、酶免疫技术 酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原进行抗原抗酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原进行抗原抗体反应。体反应。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)属固相酶免疫测定 ELISA原理
8、：把待测标本(含有未知抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的顺序与固相抗原或抗体起反应，再洗涤固相载体，随后加入酶的底物，底物受酶催化转变为有色产物。根据颜色的深浅对待测物质定性或定量。三种试剂：固相抗原或抗体固相抗原或抗体 即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表面，同时保留它们的免疫活性；面，同时保留它们的免疫活性；酶标抗原或抗体酶标抗原或抗体 即把某些酶用合适的方法连接到抗原或抗体表面，即把某些酶用合适的方法连接到抗原或抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。常同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是用的酶是辣根过氧化物酶辣根
9、过氧化物酶(HRP)(HRP)和碱性磷酸酶和碱性磷酸酶(AP)(AP)；酶作用的底物酶作用的底物 常用的底物是常用的底物是邻苯二胺邻苯二胺ELISA的类型：(1)双抗体夹心法 测抗原测抗原 1 1）已知抗体包被）已知抗体包被 2 2）洗板）洗板 3 3）加待检抗原标本）加待检抗原标本 4 4）洗板）洗板 5 5）加酶标记抗体）加酶标记抗体 6 6）洗板）洗板 7 7）加底物显色，测定）加底物显色，测定 （2）间接法 测抗体测抗体 1 1）己知抗原包被）己知抗原包被 2 2）洗板）洗板 3 3）加待检病人血清）加待检病人血清 4 4）洗板）洗板 5 5）加酶标记抗人）加酶标记抗人IgGIgG 6
10、 6）洗板）洗板 7 7）加底物显色，测定）加底物显色，测定（3）竞争法 测抗原或抗体测抗原或抗体 测定抗原：在待测管中加入受检抗原和酶标抗原，测定抗原：在待测管中加入受检抗原和酶标抗原，使它们同固相抗体进行竞争性结合。使它们同固相抗体进行竞争性结合。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法间接法Ag待检血清 酶标抗抗体检测检测抗体抗体双抗体法双抗体法Ag检测检测抗原抗原待检抗原抗原竞抗原竞争法争法Ag待检抗原酶标抗原Ag检测检测抗原抗原 2、胶体金免疫技术、胶体金免疫技术 以胶体金为标记物的抗原抗体反应。常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等。斑点金免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)以硝酸纤维素膜为载体 如早早孕试验 荧光免疫技术荧光免疫技术 化学发光免疫技术化学发光免疫技术 细胞免疫功能测定细胞免疫功能测定 流式细胞测定技术及流式细胞测定技术及HLA分型技术分型技术 请同学们参看免疫实验视听教材和请同学们参看免疫实验视听教材和CAI课件课件