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1、关于实验十三酶联免疫分析第一页，讲稿共二十八页哦一、一、ELISA 的发展历程的发展历程免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一新型血清学技术。疫分析之后发展起来的一新型血清学技术。19661966年，年，NakaneNakane和和AvrameasAvrameas等分别报道用酶代替荧光等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了素标记抗体，建立了酶标抗体技术酶标抗体技术，用于生物组织，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。中抗原的定位和鉴定。19711971年，年，EngvallEngvall，Van Weemen Van Weemen
2、 等报道了酶联免疫等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。第二页，讲稿共二十八页哦2020世纪世纪8080年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。方法之一。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（enzyme linked enzyme linked immunosorbent assayimmunoso
3、rbent assay），简称），简称ELISAELISA。第三页，讲稿共二十八页哦二、ELISA 的原理抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合催化作用相结合基础基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。又保留其酶的活性。第四页，讲稿共二十八页哦检测过程检测过程包被包被封闭封闭受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应
4、受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应加入酶标记抗原或抗体加入酶标记抗原或抗体加入酶反应的底物加入酶反应的底物底物被酶催化成为有色产物底物被酶催化成为有色产物进行定性或定量分析进行定性或定量分析第五页，讲稿共二十八页哦三、三、ELISAELISA的类型的类型ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：剂：（1 1）固相抗原或抗体，即固相抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”；（2 2）酶标记抗原或抗体，称为酶标记抗原或抗体，称为“结合物结合物”；（3 3）酶反应的底物。酶反应的底物。可
5、设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。第六页，讲稿共二十八页哦双抗体夹心法示意图双抗体夹心法示意图固相载体固相载体抗体抗体抗原抗原酶酶抗体抗体酶标记抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合再加入酶标记抗体，则结合为抗体为抗体-抗原抗原-酶标记抗体复合酶标记抗体复合物。物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。第七页，讲稿共二十八页哦双抗原夹心法示意图双抗原夹心法示意图1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.如样品
6、中含有抗体，则结合如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合再加入酶标记抗原，则结合为抗原为抗原-抗体抗体-酶标记抗原复合酶标记抗原复合物。物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。酶酶抗原抗原酶标记酶标记 抗原抗原抗体抗体抗原抗原固相载体固相载体第八页，讲稿共二十八页哦酶酶抗抗抗抗体体酶标记酶标记抗抗体抗抗体抗体抗体抗原抗原固相载体固相载体1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原合为抗原
7、-抗体抗体-酶标记抗抗体酶标记抗抗体复合物。复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。间接法示意图间接法示意图第九页，讲稿共二十八页哦捕捉法示意图捕捉法示意图酶酶抗体抗体酶标记酶标记 抗体抗体抗原抗原抗抗体抗抗体固相载体固相载体抗体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合如样品中含有抗体，则结合为抗抗体为抗抗体-抗体复合物。抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体合为抗抗体-抗体抗体-抗原抗原-酶标记抗酶标记抗体复合物。体复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。第十页，讲稿共二十八页哦酶标抗原竞
8、争法示意图酶标抗原竞争法示意图固相载体固相载体抗体抗体抗原抗原酶酶酶标记抗原酶标记抗原1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合结合抗体，结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.加入酶标记抗原，抗原没有加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点，酶标记抗原去占结合的位点，酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原据，则结合为酶标记抗原-抗体抗体复合物。复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。抗原抗原第十一页，讲稿共二十八页哦四、四、ELISAELISA的试剂的试剂ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂
9、、结合物和酶的底中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。物。1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；3 3）酶的底物；）酶的底物；4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；6 6）洗涤液；）洗涤液；7 7）酶反应终止液）酶反应终止液第十二页，讲稿共二十八页哦免疫吸附剂免疫吸附剂固相载体固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能
10、，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯聚氯乙烯-聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透吸附性能好，空白值低，孔底透明度高明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。性能相近。第十三页，讲稿共二十八页哦第十四页，讲稿共二十八页哦将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被包被(coating)(
11、coating)。蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，依靠两者的疏水基团之间的作用。的，依靠两者的疏水基团之间的作用。不易吸附的非蛋白质不易吸附的非蛋白质抗原可以间接包被，采用捕获抗原可以间接包被，采用捕获包被法。包被法。脂类物质脂类物质，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入后加入ELISAELISA板孔中，待溶剂挥发，让脂质自然干固板孔中，待溶剂挥发，让脂质自然干固在固相表面。在固相表面。包被方式包被方式第十五页，讲稿共二十八页哦包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原
12、、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。合到固相载体表面。第十六页，讲稿共二十八页哦包被用抗体包被用抗体取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须纯化后才能用取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须纯化后才能用于于ELISAEL
13、ISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。的效果。第十七页，讲稿共二十八页哦包被的条件包被的条件缓冲液：缓冲液：pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过
14、夜，3737中中保温保温2 2小时。小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，需包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，需实验选定。一般蛋白质的包被浓度为实验选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-10ng/ml-20ug/ml20ug/ml。第十八页，讲稿共二十八页哦封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥而排斥ELISAELISA后续步骤中干扰物质的再吸附。后续步骤中
15、干扰物质的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA;10%BSA;10%的小牛血清的小牛血清或或1%1%明胶明胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,可以高浓度使用（可以高浓度使用（5%5%）。）。所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭。固相均需封闭。第十九页，讲稿共二十八页哦结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂酶的催化活性酶的催化活性抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原）结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定
16、性。第二十页，讲稿共二十八页哦结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体制备结合物时，抗原或抗体在与酶联结时，避制备结合物时，抗原或抗体在与酶联结时，避免有其他杂蛋白的干扰，最好用层析纯化的抗免有其他杂蛋白的干扰，最好用层析纯化的抗体，使全部酶结合物均具有特异的免疫活性，体，使全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。抗原必须是高纯度的。第二十一页，讲稿共二十八页哦 酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性
17、质纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，由主
18、酶（酶蛋白）和辅基（亚，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。第二十二页，讲稿共二十八页哦底物底物HRPHRP的底物的底物 DH DH2 2+H+H2 2O O2 2 D D+2H+2H2 2O O 上式中，上式中，DHDH2 2为供氢体，为供氢体，H H2 2O O2 2为受氢体。为受氢体。DHDH2 2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DHDH2 2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺(TMB)(TMB)等。等。第二十三页，
19、讲稿共二十八页哦邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)氧化后的产物呈橙红色，用氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常用的结合物最常用的底物。底物。四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)经经HRPHRP作用后共产物显作用后共产物显蓝色。蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成溶液试剂，性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止溶液混和即成应用液。酶反应终止后，后，TMBTMB产物呈黄色，可在比色计中定量，最
20、产物呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为适吸收波长为450nm450nm。第二十四页，讲稿共二十八页哦五、基本操作注意事项五、基本操作注意事项加样加样:在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISAELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。不可溅出，不可产生气泡。第二十五页，讲稿共二十八页哦保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育应注意温育的温度和时间应按规定
21、力求准确。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。两块板同时测定。第二十六页，讲稿共二十八页哦洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。也决定着实验的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。第二十七页，讲稿共二十八页哦2022/10/3感谢大家观看第二十八页，讲稿共二十八页哦