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1、重量分析重量分析滴定分析滴定分析色谱法色谱法分光光度法分光光度法电化学分析电化学分析剩余碘量法剩余碘量法置换碘量法置换碘量法高效液相色谱的基本定性参数高效液相色谱的基本定性参数 1、保留时间（、保留时间（tR） 2、死时间（、死时间（t0） 3、保留体积（、保留体积（VR） 4、死体积（、死体积（V0） 5、柱效参数：、柱效参数： a. 区域宽度：在一定条件下，区域宽度越区域宽度：在一定条件下，区域宽度越 大（峰越胖），柱效越低。大（峰越胖），柱效越低。 i)标准偏差：拐点处的峰宽之半。标准偏差：拐点处的峰宽之半。 ii)半峰宽：色谱峰峰高一半处的峰宽。半峰宽：色谱峰峰高一半处的峰宽。 iii
2、)峰宽：通过色谱峰两侧的拐点作切线峰宽：通过色谱峰两侧的拐点作切线 在基线上所截的距离。在基线上所截的距离。 b.理论塔板数和理论塔板高度：理论塔板数和理论塔板高度： i)可由色谱峰的保留时间和区域宽度计算可由色谱峰的保留时间和区域宽度计算 ii)理论塔板高度理论塔板高度 组分的保留时间越长，组分的保留时间越长， 、 W h/2 、W越小，越小，则理论塔板数越大，柱效越高。则理论塔板数越大，柱效越高。 n = ( t R /) 2 =5.54 (t R / W h/2 ) 2 H = 2 / L系统适用性试验系统适用性试验 按药典各品种项下要求对仪器进行适按药典各品种项下要求对仪器进行适用性试
3、验，即用规定的对照品对仪器进行用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱的析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度最小理论板数、分离度重复性和拖尾因子重复性和拖尾因子。（1）色谱柱的理论板数（）色谱柱的理论板数（n）：）： 在选定的条件下，注入供试品溶液或药典在选定的条件下，注入供试品溶液或药典各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分或内标物质峰的保留时间量出供试品主要成分或内标物质峰的保留时间tR和和半峰宽，按半峰宽，按n=5.54(tR/wA/2)2计算
4、色谱柱的理论板数。计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于药典各品种项下规定的最如果测得理论板数低于药典各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。达到要求。 （2） 分离度：分离度： 定量分析时，为便于定量分析时，为便于准确测量准确测量，要求，要求定量峰与其他峰或内标峰定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离之间有较好的分离度，分离度度，分离度R的计算公式为：的计算公式为： R=2（tR2-tR1）/(w1+w2)式中式中 tR2为相邻两
5、峰中后一峰的保留时间为相邻两峰中后一峰的保留时间 tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间为相邻两峰中前一峰的保留时间 w1及及w2为相邻两峰的峰宽为相邻两峰的峰宽分离度要求：大于分离度要求：大于1.5（3 3）重复性）重复性 取个品种项下的对照溶液，连续进样取个品种项下的对照溶液，连续进样5 5次，峰次，峰面积测量值的相对标准偏差不大于面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%2.0% 也可按各品种校正因子测定项下，配制相当也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于于80%,100%80%,100%和和120% 120% 的对照溶液，加入规定量的内的对照溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液
6、，分别注样至标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样至少少2 2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于大于2.0%2.0%。 （4）拖尾因子）拖尾因子：为保证：为保证测量精度测量精度，特别当采用峰高，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T） 是否符合药典是否符合药典各品种项下的规定或不同浓度进样的校正因子误差是否符各品种项下的规定或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：合要求。拖尾因子计算公式为： T=w0.05h/2d1 式中式中 w0.05h为为0.05峰高处的峰宽峰高处的峰宽
7、 d1为峰极大至峰前沿之间的距离为峰极大至峰前沿之间的距离除另有规定外，除另有规定外，T应在应在0.95-1.05间间定量分析定量分析 HPLC定量分析的参数是色谱峰定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是高和峰面积，定量依据是样品中组分样品中组分的量与峰高或峰面积成正比的量与峰高或峰面积成正比。常用的。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。定量方法有外标法、内标法和内加法。 1、定量分析参数的选择：峰高，峰面积、定量分析参数的选择：峰高，峰面积 2、外标法：、外标法： 用与待测组分同质的标准品作对照品，以用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法。又可分对照品
8、的量对比求算试样含量的方法。又可分为外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法。为外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法。 在在HPLC中，因进样量大，且用六通阀定中，因进样量大，且用六通阀定量进样，误差相对较小，所以外标法是量进样，误差相对较小，所以外标法是HPLC常用的定量分析方法。常用的定量分析方法。 a.工作曲线法：工作曲线法： 用对照品配制系列浓度的对照品溶液，准用对照品配制系列浓度的对照品溶液，准确进样，测量峰面积或峰高，对浓度确进样，测量峰面积或峰高，对浓度C绘制标绘制标准曲线，利用此曲线或它的回归方程式计算样准曲线，利用此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量。品溶液的含量。 b.
9、外标一点法：外标一点法： 用一种浓度的对照品溶液对比求算样品含量用一种浓度的对照品溶液对比求算样品含量的方法，只有在工作曲线通过原点，即截距为零的方法，只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析。时，才可用外标一点法进行定量分析。2、内标法：、内标法： 选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。内标法的关键时选择合适的内标物。内标法的关键时选择合适的内标物。 内标物的要求：内标物的要求： 1内标物应是样品中不含有的物质内标物应是样品中不含有的物质 2
10、纯度要高纯度要高 3与待测组分有相似的理化性质，因而保留与待测组分有相似的理化性质，因而保留 时间与待测组分接近时间与待测组分接近 4与样品中各组分能完全分离且不与样品反与样品中各组分能完全分离且不与样品反 应应 内标法可分为工作曲线法、内标一点法、内标法可分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。内标二点法及校正因子法等。使用内标的作用：使用内标的作用： 可以抵消仪器稳定性差，进样量不可以抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。如够准确等原因带来的定量分析误差。如果在样品预处理前加入内标物，则可抵果在样品预处理前加入内标物，则可抵消方法全过程引起的误差。消方法全
11、过程引起的误差。 Ai/As =a+bCi 将与对照品溶液中相同量的内标物加至将与对照品溶液中相同量的内标物加至样品溶液中，分别测量样品中样品溶液中，分别测量样品中I组分与内标物组分与内标物峰面积（或峰高），以两者峰面积或峰高之峰面积（或峰高），以两者峰面积或峰高之比代入回归方程式计算出样品中比代入回归方程式计算出样品中i组分的含量。组分的含量。a.工作曲线法：工作曲线法： 与外标法相似，只是在各种浓度的对照与外标法相似，只是在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。分别测量品溶液中加入相同量的内标物。分别测量I组组分与内标物分与内标物S的峰面积的峰面积A（或峰高（或峰高h)，以峰面，以峰面
12、积比积比Ai/As与与Ci绘制工作曲线，或求出回归方绘制工作曲线，或求出回归方程式。程式。b. 内标对比法：内标对比法： 只配制一个浓度的对照品溶液，然后在只配制一个浓度的对照品溶液，然后在样品与对照品溶液中加入相同量的内标物，样品与对照品溶液中加入相同量的内标物，分别进样。按下式计算样品浓度。分别进样。按下式计算样品浓度。 与外标法相似，只有线性关系好且截距与外标法相似，只有线性关系好且截距a为为零时才可用内标一点法定量。零时才可用内标一点法定量。(Ci)样样 （Ai/As）样样（Ai/As）对对x Ci对照对照c.内标校正因子法：内标校正因子法： 在在HPLC分析中，等量的不同物质在相同分
13、析中，等量的不同物质在相同实验条件下，在同一检测器上的响应值经常不实验条件下，在同一检测器上的响应值经常不同，为了校正这种响应的差别，引入了校正因同，为了校正这种响应的差别，引入了校正因子的概念。子的概念。 f 定义为定义为：被测组分单位峰面积（或峰高）：被测组分单位峰面积（或峰高）所相当物质的量与参比物质（内标物）单位峰所相当物质的量与参比物质（内标物）单位峰面积（或峰高）所相当物质的量的比值。面积（或峰高）所相当物质的量的比值。1）校正因子（）校正因子（f）=A s / m s A r / m r2）含量（）含量（m x)= f X Ax A s/m s d. 内加法：内加法： 将待测组分
14、将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的组分的峰面积增量，求算峰面积增量，求算i组分的含量。此法不需要内组分的含量。此法不需要内标物，又能克服由于进样量不准确所带来的定标物，又能克服由于进样量不准确所带来的定量分析误差。量分析误差。mi =Ai / Ai * mimi是纯物质是纯物质i的加入量，的加入量，Ai是相应增加的峰面是相应增加的峰面积积梯梯 度度 洗洗 脱脱 HPLC的色谱洗脱技术有的色谱洗脱技术有等强度等强度和和梯度洗梯度洗脱脱两种两种。等强度洗脱等强度洗脱： 在同一分析周期内流动相组
15、成保持恒定，在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱：梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术，使所有的组分都在适宜须采用梯度洗脱技术，使所有的组分都在适宜的条件下获得分离。的条件下获得分离。优点：优点：能缩短分析时间，提高分离度、改善峰能缩短分析时间，提高分离度、改善峰 形，提高检测灵敏度。形，提高检测灵
16、敏度。缺点：缺点：常引起基线漂移和降低重现性。常引起基线漂移和降低重现性。第五节第五节 分析方法的验证分析方法的验证 1 1、准确度（、准确度（accuracyaccuracy） 指分析方法所得的测定结果与真实值或参考值接近的程度。指分析方法所得的测定结果与真实值或参考值接近的程度。一般以回收率表示。一般以回收率表示。 原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，也可以原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，也可以将验证方法的测定结果与另一已建立的准确可靠方法的测定结果将验证方法的测定结果与另一已建立的准确可靠方法的测定结果进行对比来确定。进行对比来确定。 制剂可用含已知量被测物的各组分混
17、合物进行测定。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。 至少用至少用9 9个测定结果进行评价。个测定结果进行评价。 2、精密度（、精密度（precision） 指在规定的测试条件下，同一均匀样品进行多次测定，所指在规定的测试条件下，同一均匀样品进行多次测定，所得的结果彼此符合的程度。精密度通常以偏差、标准偏差或相得的结果彼此符合的程度。精密度通常以偏差、标准偏差或相对标准差（对标准差（RSD）来表示。）来表示。 一个分析方法的精密度好，说明方法稳定，测定的结果重一个分析方法的精密度好，说明方法稳定，测定的结果重复性好，但方法的精密度好，准确度不一定高。复性好，但方法的精密度好，准确度不一
18、定高。重复性重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。密度。中间精密度中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。同设备测定结果之间的精密度。重现性重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度。：在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度。3、专属性（、专属性（specificity）：）： 指在其它成分（如杂质、辅料等）可能存在的指在其它成分（如杂质、辅料等）可能存在的情况下，分析方法能准确地测出被测组分的能力。情况下，分析方法能准
19、确地测出被测组分的能力。 4、检测限（、检测限（limit of detection, LOD） 指分析方法在规定的实验条件下所能检出被测组指分析方法在规定的实验条件下所能检出被测组分的最低量。分的最低量。非仪器分析目视法非仪器分析目视法信噪比法信噪比法5、定量限（、定量限（limit of quantitation, LOQ） 指分析方法可定量测定样品中测定组分的最低量。定指分析方法可定量测定样品中测定组分的最低量。定量限与检测限的区别在于，它所规定的最低浓度，应满足量限与检测限的区别在于，它所规定的最低浓度，应满足一定的精密度和准确度的要求。一般以信噪比一定的精密度和准确度的要求。一般以信噪比10：1确定确定为定量限。为定量限。6、线性（、线性（linearity ） 指分析方法在一定范围内获得的检测结果和样品中测定指分析方法在一定范围内获得的检测结果和样品中测定组分的浓度成正比关系的程度。组分的浓度成正比关系的程度。7、范围（、范围（range） 能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。用的高低限浓度或量的区间。8、耐用性（、耐用性（ruggedness） 指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。承受程度。