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1、第三章第三章 酶的化学修饰酶的化学修饰q酶酶的的化化学学修修饰饰（Chemical Chemical modificationmodification）是是指指用用化化学学手手段段将将某某些些原原子子或或化化学学基基团团结结合合到到酶酶分分子子上上，或或将将酶酶分分子子中中某某基基团团改改变变，从从而而达达到到改改变变酶酶的的催催化化性性质质及及一一些些生生理理生生化性质的目的。化性质的目的。q从从酶酶动动力力学学角角度度，酶酶的的化化学学修修饰饰过过程程为为不不可逆抑制可逆抑制（激活）过程。（激活）过程。q酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研究，酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研究，医药、农业
2、、酶工程、生化工程等领域。医药、农业、酶工程、生化工程等领域。化学修饰具有易实现，作用快，成本低等化学修饰具有易实现，作用快，成本低等优点，是一项常用的重要技术。优点，是一项常用的重要技术。例如：例如：1 1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的形成亲水性的NHNHCHCH2 2COOHCOOH后，该酶对后，该酶对6060C C热处理的稳定性增高了热处理的稳定性增高了10001000倍。倍。2 2、超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide superoxide dismutase,SOD)dismutase,SOD)、尿酸酶等用尿酸酶等
3、用PEGPEG修饰修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存速度，酶的活力可以保存15154545。回顾酶分子的几个部分肽肽链链：酶酶分分子子的的骨骨架架，形形成成基基本本的的空空间间结结构构，酶分子的基础。酶分子的基础。N端端及及C端端：氨氨基基和和羧羧基基有有参参加加催催化化功功能能的的可可能。能。侧侧链链基基团团：是是形形成成活活性性中中心心特特定定构构象象和和性性质质的的组组成成部部分分，是是完完成成催催化化反反应应的的实实际际参参加加者。者。对对侧链基团侧链基团
4、进行化学修饰是进行化学修饰是改造酶的性质和功能的重要手段。改造酶的性质和功能的重要手段。第一节第一节化学修饰的方法学化学修饰的方法学 着手蛋白质修饰工作时着手蛋白质修饰工作时,首先碰到的首先碰到的是是修饰试剂修饰试剂和和修饰条件修饰条件的选择的选择,以期提高以期提高修饰反应的专一性修饰反应的专一性,获得获得满意的修饰结果满意的修饰结果。1、试剂的选择实实验验目目的的不不同同,对对专专一一性性的的要要求求也也不不同同,因因此此,选选择择试试剂剂在在很很大大程程度度上上要要依依据据修修饰饰目的。目的。例如例如,对对氨基氨基的修饰有几种情况的修饰有几种情况:修饰修饰所有氨基所有氨基,而不修饰其他基团
5、而不修饰其他基团;仅修饰仅修饰-氨基氨基;修饰修饰暴露的或反应性高暴露的或反应性高的氨基的氨基修饰修饰具有催化活性的氨基具有催化活性的氨基等。等。选择蛋白质修饰剂要考虑的问题选择蛋白质修饰剂要考虑的问题:修饰反应要完成到修饰反应要完成到什么程度什么程度;对个别氨基酸残基对个别氨基酸残基是否专一是否专一;在反应条件下在反应条件下,修饰反应修饰反应有没有限度有没有限度;修饰后蛋白质的构象修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变是否基本保持不变;是否需要分离修饰后的是否需要分离修饰后的衍生物衍生物;反应反应是否需要可逆是否需要可逆；能否建立能否建立快速快速、方便的分析方法方便的分析方法等。等。特别注意：特
6、别注意：修修饰饰酶酶活活性性部部位位的的氨氨基基酸酸残残基基的的试试剂应具备以下特征剂应具备以下特征:选择性地与一个氨基酸残基反应选择性地与一个氨基酸残基反应;反应在酶蛋白不变性的条件下进行反应在酶蛋白不变性的条件下进行;标标记记的的残残基基在在肽肽中中稳稳定定,很很易易通通过过降降解解分分离出来离出来,进行鉴定进行鉴定:反应的程度能用简单的技术测定。反应的程度能用简单的技术测定。2、反应条件的选择除除允允许许修修饰饰能能顺顺利利进进行行外外,还还必必须须满满足足如下要求：如下要求：不造成蛋白质的不可逆不造成蛋白质的不可逆变性变性。有利于有利于专一性专一性修饰蛋白质。修饰蛋白质。为为此此,反反
7、应应条条件件应应尽尽可可能能在在保保证证蛋蛋白白质质特特定定空空间间构构象象不不变变或或少少变变的的情情况况下下进进行行。反反应应的的温温度度、pH都都要要小小心心控控制制。反反应应介介质质和缓冲液组成也要有所考虑。和缓冲液组成也要有所考虑。3.反应的专一性专专一一性性非非常常重重要要。除除控控制制反反应应条条件件外外,还可利用其他途径来实现修饰的专一性。还可利用其他途径来实现修饰的专一性。利用蛋白质分子中某些基团的利用蛋白质分子中某些基团的特殊性特殊性。例例：二二异异丙丙基基氟氟磷磷酸酸酯酯(DFP)能能与与胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的活活性性丝丝氨氨酸酸作作用用,迅迅速速导导致致酶酶失失活
8、活。但但DFP在在同同样样条条件件下下却却不不能能与与胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶原原及及一一些些简简单单的的模模拟拟化化合合物物作作用用。这这种种现现象象称称为为位位置置专专一一性性,因因为为这这是是由由于于它它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。选择不同的反应选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反应是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度也就控制了各功能基的解离程度,从从而有利于而有利于修饰的专一性修饰的专一性。例如：例如：碘代乙酸碘代乙酸对蛋白质进行修饰
9、时对蛋白质进行修饰时,试剂可与试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及的侧链及-氨氨基、基、-氨基发生作用。氨基发生作用。利用某些产物的不稳定性利用某些产物的不稳定性亲和标记亲和标记差别标记差别标记利用蛋白质状态的差异利用蛋白质状态的差异第二节第二节 酶蛋白侧链的化学修饰酶蛋白侧链的化学修饰1、蛋白质侧链上的功能基主要有:氨基（氨基（N端，赖氨酸，精氨酸），端，赖氨酸，精氨酸），巯基（半胱氨酸），巯基（半胱氨酸），羧基（天冬氨酸、谷氨酸），羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑基（组氨酸），咪唑基（组氨酸），吲哚基吲哚基胍基胍基2、各
10、基团的化学修饰（1）修饰）修饰羧基羧基（三类修饰剂）（三类修饰剂）1)碳二亚胺类碳二亚胺类+2)甲醇甲醇ll+CH3OHHCl+H2O3）硼氟化三甲烊盐硼氟化三甲烊盐（CH3）3OBF4+l+HBF4+CH3OCH3（2）修饰氨基（四类）修饰氨基（四类）赖氨酸氨基有很高的亲核反应性，可赖氨酸氨基有很高的亲核反应性，可用多种酰基化试剂或烷基化试剂对其修用多种酰基化试剂或烷基化试剂对其修饰饰1）烷基化烷基化2）酰基化）酰基化乙酸酐：乙酸酐：丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）：）：3）还原烷基化）还原烷基化4）一一个个常常用用的的特特异异修修饰饰赖赖氨氨酸酸氨氨基基的的试剂：磷酸吡哆醛试剂：磷酸吡哆醛（3
11、）修饰胍基）修饰胍基（两类）（两类）1）二酮：）二酮：丁二酮：丁二酮：环己二酮：环己二酮：2）苯乙二醛）苯乙二醛：（4）修饰巯基（四类）修饰巯基（四类）巯基是活性部位最常出现的基团，也巯基是活性部位最常出现的基团，也是有最多修饰剂的基团。巯基修饰剂可是有最多修饰剂的基团。巯基修饰剂可分为以下四类：二硫键交换，烷基化，分为以下四类：二硫键交换，烷基化，酰基化，重金属化合物。酰基化，重金属化合物。1）二硫键交换：）二硫键交换：ESH+RSSRESSR+RSHESH+ESSRESSE+RSH 与与SH进行二硫键交换后，进行二硫键交换后，SH被修被修饰，试剂的另一半以单体放出。饰，试剂的另一半以单体放
12、出。常用的二硫键交换试剂：常用的二硫键交换试剂：DTNB，5,5-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate)二硫二吡啶，二硫二吡啶，4,4-dithiodipyridine（或或2,2-dithiodipyridine）二硫键交换产生的单体在一定波长下有二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大光吸收，可用分光光度法定量连续很大光吸收，可用分光光度法定量连续监测。监测。2 2）重金属化合物：）重金属化合物：对氯汞苯甲酸（对氯汞苯甲酸（PCMBPCMB）ESH+HCl2-2-氯汞氯汞-4-4-硝基酚硝基酚ESH+HCl3 3）烷基化：）烷基化：E-SH+R-X E-SR+HX E-SH
13、+R-X E-SR+HX常用烷基化试剂：常用烷基化试剂：碘代乙酰胺（碘代乙酰胺（IAM）碘代乙酸碘代乙酸（IAA）一个常用的专一修饰巯基试剂：一个常用的专一修饰巯基试剂：N-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）:ESH4 4）酰基化：）酰基化：OESH E-S-C-R+HX（5）修饰咪唑基（两种）修饰咪唑基（两种）通通常常通通过过对对咪咪唑唑基基上上氮氮原原子子酰酰基基化化或或烷烷基化修饰组氨酸咪唑基。基化修饰组氨酸咪唑基。1)焦碳酸二乙脂（焦碳酸二乙脂（diethylparacarbonate）是最常用的一个试剂：是最常用的一个试剂：+C2H5OH+CO22)碘代乙酸：+ICH
14、2COOH+HI（6 6）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂：N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺（7）修饰酪氨酸残基（三种）修饰酪氨酸残基（三种）1）碘化反应：）碘化反应：I2+HI2）硝化：）硝化：（NO2)4C+(NO2)3CH3）N-乙酰咪唑乙酰咪唑:N-ethylimidazole氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基
15、水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂3.有机大分子对酶的化学修饰有机大分子对酶的化学修饰是利用一有机大分子对酶的化学修饰是利用一些活性分子把特定的有机大分子结合到
16、些活性分子把特定的有机大分子结合到酶上，以改变酶的生理、生化性质，实酶上，以改变酶的生理、生化性质，实现特定目的的技术。现特定目的的技术。该技术可用于改变酶的稳定性、组织分该技术可用于改变酶的稳定性、组织分布性、抗原性及其它生化性质，在医药、布性、抗原性及其它生化性质，在医药、工业等领域有着广泛的应用前景。工业等领域有着广泛的应用前景。1）聚乙二醇）聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）聚乙二醇是一个线性分子，有良好的聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容性，在体内不残留，无毒，无生物相容性，在体内不残留，无毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。抗原性，是一种优良修饰剂。其修饰方
17、法有多种，如三氯均嗪法、其修饰方法有多种，如三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法等。叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法等。三氯均嗪法是一个常用的方法。三氯三氯均嗪法是一个常用的方法。三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代。均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代。三个氯原子反应性依次下降。三个氯原子反应性依次下降。2）右旋糖酐）右旋糖酐右旋糖酐是由右旋糖酐是由-葡萄糖经葡萄糖经-1，6糖酐糖酐键形成的多糖，有较好的水溶性及生物键形成的多糖，有较好的水溶性及生物相容性，可用作相容性，可用作代血浆代血浆。右旋糖酐链上的右旋糖酐链上的双羟基结构双羟基结构经活化后经活化后可与酶上的自由氨基相结合。可与酶上的自由氨
18、基相结合。溴化氰法溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下活化，用方法。邻双羟基在溴化氰作用下活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应，共价结合。应，共价结合。3）肝素）肝素肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性，适肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性，适于修饰溶栓酶类以增加疗效。于修饰溶栓酶类以增加疗效。碳二亚胺法碳二亚胺法5 5）白蛋白）白蛋白碳二亚胺法碳二亚胺法第三节第三节 酶的亲和修饰酶的亲和修饰亲和标记亲和标记(AffinityLabeling）亲和标记是最有意义的一种化学修饰，这亲和标记是最有意义的一种化学修饰
19、，这是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失活。亲团，一般是必需基团，而造成不可逆失活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团。共同的结合于酶的基团。作用于组氨酸侧链的试剂作用于组氨酸侧链的试剂TPCK和和TLCK是一个典型例子是一个典型例子TPCKTLCK 亲和标记试剂在酶上具有特定结合部亲和标
20、记试剂在酶上具有特定结合部位，其解离常数也易于测定，可以提供位，其解离常数也易于测定，可以提供酶的结构信息，是理论研究中的一类常酶的结构信息，是理论研究中的一类常用的修饰剂。用的修饰剂。亲和标记试剂一般可以在较低浓度下亲和标记试剂一般可以在较低浓度下有效修饰酶，改变酶的活性，特别是专有效修饰酶，改变酶的活性，特别是专一性较强，是药物等的优良候选者，有一性较强，是药物等的优良候选者，有广泛的应用价值。广泛的应用价值。第四节第四节酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用酶经过化学修饰后会产生的变化：酶经过化学修饰后会产生的变化：1.提高生物活性；提高生物活性；2.增强在不良环境中的稳定性；增强在不良环境中
21、的稳定性；3.针对特异性反应降低生物识别能力，解针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；除免疫原性；4.产生新的催化能力。产生新的催化能力。在医药方面在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。降低免疫原性和抗原性。在生物技术领域在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适性和最适ph等酶学性质。等酶学性质。在酶结构功能研究中在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；心研究；2.确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。