细胞培养技术入门ppt课件.ppt

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1、细胞培养技术入门细胞培养技术入门 在细胞培养中注意的一些问题在细胞培养中注意的一些问题 细胞培养的实验程序细胞培养的实验程序 细胞的复苏细胞的复苏 细胞的计数细胞的计数 细胞细胞( (贴壁贴壁) )的的传代培养传代培养 细胞的冻存细胞的冻存 悬浮细胞的培养方法悬浮细胞的培养方法 在细胞培养中注意的一些问题在细胞培养中注意的一些问题 环环 境境 由于体外培养细胞没有抗感染能力，若由于体外培养细胞没有抗感染能力，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境

2、更为重要。和完全可靠，特别是实验环境更为重要。 1.1.培养室和超净台的消毒培养室和超净台的消毒 培养室培养室 无菌培养室每天都要用速消净或无菌培养室每天都要用速消净或0.20.2的的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒专用），紫外线照射消毒303050min50min。 超净工作台超净工作台 台面每次实验前要用台面每次实验前要用 75酒精酒精擦洗，然后紫外线消毒擦洗，然后紫外线消毒30 min。消毒时工作台。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用

3、具如移液器、线，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用废液缸。污物盒、试管架等用75酒精擦洗后酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。线。2. 2. 培养前准备培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实验计划在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，清点无误后将

4、其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。因物品不全往返拿取而增加污染机会。3. 3. 培养条件培养条件 气体环境：气体环境：9595空气加空气加5 5COCO2 2混和气体混和气体环境中。环境中。 PHPH值：值：7.27.27.47.4 温度：温度：37 培养实验用品的前期处理培养实验用品的前期处理1.1.清洗和浸泡清洗和浸泡: :(1)玻璃器皿玻璃器皿: :新的玻璃器皿在生产过程中常新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒

5、的物质，使用前必须彻底清洗。首先细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，用自来水初步刷洗，5 5稀盐酸溶液中浸泡过夜。稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗然后用流水彻底冲洗3-53-5遍，单蒸馏水漂洗遍，单蒸馏水漂洗3 3遍，遍，三（双）蒸水漂洗三（双）蒸水漂洗2 2遍，烘干备用。遍，烘干备用。 （2)2)塑料器皿塑料器皿: :塑料器皿经冲净后，晾干，塑料器皿经冲净后，晾干，用用2 2NaOHNaOH浸泡过夜，自来水冲洗，浸泡过夜，自来水冲洗，5 5盐酸浸盐酸浸泡泡30min30min，流水彻底冲洗，流水彻底冲洗3-53-5遍，单蒸馏水漂洗遍，单蒸馏水漂洗3 3遍，三（双

6、）蒸水漂洗遍，三（双）蒸水漂洗2 2遍，烘干备用。针头式遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸液滤器不能泡酸液, ,用用2 2NaOHNaOH泡泡6 61212小时小时, ,或者或者煮沸煮沸2020分钟分钟, ,常规冲洗干净，烘干（常规冲洗干净，烘干（6060以下）以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上时注意光面朝上( (凹向上凹向上) )，然后用注射器回抽，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微安装好膜后将螺旋稍微 拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用

7、纸包装备用。注意在超净台内取出使用时层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用洗干净烘干后，用2 2氢氧化钠溶液煮沸氢氧化钠溶液煮沸3030分钟分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理处理3030钟），自来水洗净，烘干然后再泡入钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1 1稀盐酸液中稀盐酸液中3030分钟，用自来水彻底冲洗分钟，用自来水彻底冲洗3-53-5遍，遍，蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗3 3遍，三（双）蒸漂洗遍，三（双）蒸漂洗2 2遍，烘干备遍，烘干备用。用。2.

8、2.包装：包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。消毒日期等。 3.3.消毒消毒: : 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的

9、用品被污染）来完成。被污染）来完成。（1 1）消毒灭菌的方法）消毒灭菌的方法 : 物理方法物理方法: : 湿热（高压蒸汽）、干热、湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物去除微生物. . 化学方法化学方法: :使用化学消毒剂、抗菌素等使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。杀灭微生物。 (2)(2)消毒灭菌的时间：消毒灭菌的时间： 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160160，保持，保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。消毒方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开

10、，以免冷空气突完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。意外事故。 湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒，要求是：消毒，要求是： 不能装太满，保持消毒器内气体流通。不能装太满，保持消毒器内气体流通。 在加热升压之前，打开排气阀门，使加在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。热后消毒器内的残留冷空气排出。 关闭排气关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。始记录时间，并控制

11、压力恒定。 一般物品：布类、金属器械、玻璃器一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是皿等消毒的要求是 1515磅磅20 min20 min；常规使用；常规使用液体：消毒液体：消毒 1515磅磅 15 min 15 min 。橡胶和塑料用。橡胶和塑料用品品 ：如滤器、：如滤器、EPEP管、离心管等高压管、离心管等高压1010磅磅15 15 minmin。 紫外线消毒：紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空主要用于实验室房间里的空气、操作气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为30min30min2h2h左右。左右。 过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用适

12、用于组织细胞培养使用的液体的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。质具有生物活性的液体等。 4.4.细胞培养用液及培养基（液）细胞培养用液及培养基（液）: : （1 1）水：）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。双蒸水、三蒸水，可高压除菌。 （2 2）平衡盐溶液（）平衡盐溶液（PBS)PBS)：PHPH为为7.27.27.47.4，不，不含钙镁离子含钙镁离子 ，可高压除菌。，可高压除菌。（3 3）消化液）消化液 ： 胰蛋白酶液：胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为常用胰蛋白酶的浓度为0 025 25 ，pHpH值值7.27.2左右。需过滤除菌。左

13、右。需过滤除菌。 EDTAEDTA液：液：常用浓度为常用浓度为 0 00202，配制时，配制时采用无采用无CaCa2+2+、MgMg2+2+平衡盐液溶解，高压灭菌平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。后即可使用。 胰蛋白酶胰蛋白酶EDTAEDTANa2:Na2:需过滤除菌。胰需过滤除菌。胰蛋白酶和蛋白酶和EDTANaEDTANa2 2联合使用可提高消化率，联合使用可提高消化率，但需注意但需注意EDTAEDTA不能被血清中和，消化后要不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。彻底清洗，否则细胞易脱壁。 胶原酶：胶原酶：适于消化分离纤维性组织、适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞

14、与胶原成上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用分分离而不受损害。可用BSSBSS或含血清或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。提高细胞成活率。 但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为成本。胶原酶的常用剂量为 200 U200 Umlml（约为（约为 lmglmgmlml）或）或 0 003030 03 3。(4)(4)培养基（液）过滤除菌培养基（液）过滤除菌 常用常用0 022pm22pm微孔滤膜。微孔滤膜。（4 4）l640l640培养液培养液( (常用常用) )

15、（5 5）DMEMDMEM、F12F12培养液培养液 （6 6）HamHam培养液培养液 ( (无血清培养中常用的无血清培养中常用的基础培养基基础培养基) )（7 7）HepesHepes：具有较强的缓冲能力，能具有较强的缓冲能力，能常时间恒定缓冲液的常时间恒定缓冲液的PHPH值。使用浓度可根值。使用浓度可根据缓冲要求而定。据缓冲要求而定。（8 8）3% L-3% L-谷氨酰胺：谷氨酰胺：可作为细胞能量来源，可作为细胞能量来源，使用量使用量1 1。但其在溶液中极不稳定，需重新加。但其在溶液中极不稳定，需重新加入。入。（9 9）丙酮酸钠、葡萄糖：）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的是属碳水化合物

16、的成分，是细胞生命的能量来源。成分，是细胞生命的能量来源。（1010）抗生素：）抗生素：最终浓度为青霉素最终浓度为青霉素 100 U100 Umlml，链霉素链霉素100U100Umlml（青霉素为（青霉素为8080万万U U瓶，将其溶瓶，将其溶解于解于4ml4ml三蒸水中，每升培养液中加入三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml0.5ml；链霉素为链霉素为100100万万U U瓶，将其溶解在瓶，将其溶解在5ml5ml三蒸水中，三蒸水中，每升培养液加每升培养液加0.5ml0.5ml）。）。 （1111）细胞生长液：）细胞生长液：是用以维持细胞生长增是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：殖的液体。

17、其是配方：基础培养基基础培养基 80809090 血清血清 10102020 双抗双抗 100u/ml 100u/ml （1212）细胞维持液：）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方：或不死的培养液。其是配方：基础培养基基础培养基 9595 血清血清 2 25 5 双抗双抗100u/ml 100u/ml （1313）冻存液：）冻存液：其是配方：其是配方： 1010DMSO DMSO 40 40小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 1 1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 1 1双抗双抗 4848（5858）基础培养液。）基础培养液。（141

18、4）MEMMEM培养液培养液: :其是配方：其是配方： 63%MEM63%MEM液液 2020的乳蛋白水解物的乳蛋白水解物 1010的小牛血清的小牛血清 1 1的双抗（的双抗（P P、S S） 用用5.65.6NaHCONaHCO3 3溶液调溶液调pHpH至至7.27.27.47.4。细胞培养的实验程序细胞培养的实验程序细胞培养细胞培养 动物组织原代培养动物组织原代培养 细胞株的体外培养细胞株的体外培养血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内 细胞株贮存在液氮灌或细胞株贮存在液氮灌或8080细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、 以下的低温冰箱中以下的

19、低温冰箱中 肿瘤等组织肿瘤等组织 分离分离 复苏复苏组织切成组织切成1cm1cm3 3小块，方法根据样本而异。小块，方法根据样本而异。 细胞复苏时速度要快，立即放入细胞复苏时速度要快，立即放入有机械分散法、剪切分离法、消化分离法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法 37 37 水浴箱中充分溶解，立即水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分离法、胶原酶法（胰酶消化分离法、胶原酶法 ） 离心离心500500 1000r/min1000r/min1 1 2min2min，弃掉上清液。弃掉上清液。获得细胞悬液种入获得细胞悬液种入 接种入瓶中培养接种入瓶中培养培养瓶中培养培养瓶中培养 3737培养箱（或培养箱

20、（或5%CO5%CO2 2培养箱）中培养培养箱）中培养2424小时后换液小时后换液去处对细胞生长有毒物质，如去处对细胞生长有毒物质，如DMSODMSO、细胞组织残渣、细胞代谢产物、细胞组织残渣、细胞代谢产物 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞直接去掉上清液直接去掉上清液 离心去掉上清液，必要时做细胞饲离心去掉上清液，必要时做细胞饲养层以净化细胞养层以净化细胞 传代传代 细胞生长细胞生长8080以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异，以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异， 2 23 3天或天或1 1周左右一代周左右一代 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞. .消化法，用胰酶消化法，用胰

21、酶EDTANa2EDTANa2消化，消化， 直接吹打或离心法、自然沉淀法，直接吹打或离心法、自然沉淀法， 时间根据细胞而定时间根据细胞而定 吸一半液到另一瓶吸一半液到另一瓶冻存冻存冻存程序冻存程序 细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。 取对数生长期的细胞（取对数生长期的细胞（2 25 5 1O1O5 5cellscellsmlml），收集细胞前），收集细胞前24h24h换液；换液； 吸出培养液，用吸出培养液，用PBSPBS洗细胞一次，除去，加入消化液洗细胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶胰蛋白酶EDTANaEDTANa2 2（消化时间根据细胞而

22、定），去掉消化液，加入培养液充（消化时间根据细胞而定），去掉消化液，加入培养液充分混匀，分混匀，1000rp1000rp离心离心1min ,1min ,去掉上清液；去掉上清液； 重悬浮于冻存液中，大约重悬浮于冻存液中，大约1 15 5 10106 6cellscellsmlml； 每个冻存管中加入每个冻存管中加入lmllml细胞悬浮液，拧紧盖子。细胞悬浮液，拧紧盖子。 冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒30min 30min 1h1h后后, ,再放入再放入-20-200 0C C冰箱中冰箱中2h2h左右，然后转至左右，然后转至-80-800 0

23、C C冰箱，可保存数月，如冰箱，可保存数月，如需长期保存，应在需长期保存，应在-80-800 0C C冰箱中放冰箱中放3h 3h 8h8h后转至液氮中。后转至液氮中。 细胞计数细胞计数 一、原理一、原理 细胞计数结果以细胞数细胞计数结果以细胞数/ /毫升表示。在细毫升表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞

24、也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台用台盼（酚）盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂二、仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、普通显微镜、血球计数板、EPEP管、毛细吸管等。管、毛细吸管等。2 2、试剂、试剂： SP20SP20细胞、细胞、 0.40.4

25、台盼（酚）兰其台盼（酚）兰其配方是：台盼（酚）兰配方是：台盼（酚）兰 0.4g0.4g加双蒸水加双蒸水100ml100ml等。等。 3 3、材料：、材料：细胞悬液细胞悬液细胞悬液的制备：细胞悬液的制备： 用毛吸管吸用毛吸管吸5 5滴细胞悬液到滴细胞悬液到EPEP管中，加入管中，加入1 1滴滴0.40.4台盼蓝染液或苯胺黑，混匀，静置台盼蓝染液或苯胺黑，混匀，静置2 23min,3min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。三、三、操作步骤操作步骤 1 1、将血球计

26、数板及盖片用软纱布擦试干净，、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。并将盖片盖在计数板上。 2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。使悬液充满盖片和计数板之间。 3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。 4 4、镜下观察，计算计数板四个大、镜下观察，计算计数板四个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （ 四个大格子四个大格子细胞数细胞数/4)/4)稀释倍数稀释倍数10104 4 /ml

27、 /ml 四、细胞计数要点：四、细胞计数要点： 1.1.要求悬液中细胞数目不低于要求悬液中细胞数目不低于10104 4个个/ml/ml，如，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；液中； 2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。影响计数准确性。 3.3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；求计数准确； 4.4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让操作时，注意盖片下不能

28、有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 5 5. .数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。计右线。 体外细胞的复苏与培养体外细胞的复苏与培养概述概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使很短的时

29、间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。损害。用品和试剂用品和试剂 培 养 液 、 吸 管 、 离 心 管 、 培 养 瓶 、培 养 液 、 吸 管 、 离 心 管 、 培 养 瓶 、CHOCHO/Hela/Hela细胞等。细胞等。操作步骤操作步骤（图）（图） 注注 意意 存取冻存管时都要佩戴防护眼镜和手套，存取冻存管时都要佩戴防护眼镜和手套，冻存管投入存放温水的器皿中后应立即把盖子冻存管投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。扣上，以防发生意外。 离心后上清夜一定要吸干净，以免因离心后上清夜一定要吸干净，以

30、免因DSMODSMO的毒性造成细胞活力下降而难以复活。的毒性造成细胞活力下降而难以复活。 细胞传代培养细胞传代培养一、原理一、原理 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶

31、就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材料和试剂二、材料和试剂 细胞：贴壁细胞株细胞：贴壁细胞株CHOCHO 试剂：试剂：0.250.25胰酶、胰酶、16401640培养基（含培养基（含1010小牛血清）。小牛血清）。 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等。瓶、吸管、废液缸等。 三、操作步骤三、操作步骤 将将长满长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 加入加入0.50.51ml 0.251ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。胞都浸入溶液中。 瓶

32、口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml10ml培养液终培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为温消化时间约为1 13 3分钟。分钟。 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖），置外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖）

33、，置3737下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。四、注意事项四、注意事项 形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。长。 传代时不同的细胞消化时间不同，因而要传代时不同的细胞消化时间不同，因而要根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。 吹打细

34、胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。损伤。 防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的绝种绝种，要及时冻存细胞。，要及时冻存细胞。 细胞档案要记录好，如组织来源，生物学特细胞档案要记录好，如组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。等。附附1 116401640基础培养基配置方法基础培养基配置方法: :16401640粉粉 10.4g 10.4g HepesHepes 2.3

35、8g 2.38g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 2.5g 丙酮酸钠丙酮酸钠 110mg NaHCO110mg NaHCO3 3 2g 2g 双（三）蒸水加至双（三）蒸水加至1000ml1000ml附附2 2：消化液配制方法：消化液配制方法：称取称取0.25g0.25g胰酶蛋白酶（活力为胰酶蛋白酶（活力为1 1：250250），加），加100ml100ml无无CaCa2+2+、MgMg2+2+的的HanksHanks液液( (或或PBSPBS液液) )溶解，溶解，滤器过滤除用前可在滤器过滤除用前可在3737下回温。胰酶溶液中下回温。胰酶溶液中也可加入也可加入EDTAEDTANaNa2 2，使最终浓度达

36、，使最终浓度达0.020.02。 细胞的冻细胞的冻存存 一、概述一、概述 冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在直冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水首先细胞脱水, ,部分蛋白质由于上述因素而变部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起细胞能量代谢的障碍。引起细胞能量代谢的障碍。细胞膜上的类脂蛋白复

37、合体在冷冻中易发生破坏细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内胞核内DNADNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成积膨胀造成DNADNA的空间构型发生不可逆的损伤性的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。因此变化，而引起细胞的死亡。因此在细胞冻存时要在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的

38、关键。晶的形成是减少细胞损伤的关键。 目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。这样而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。这样可以最大限度的保存细胞活力。可以最大限度的保存细胞活力。二、用品和试剂二、用品和试

39、剂 0.25 0.25胰蛋白酶。胰蛋白酶。 含含10102020( (胎牛胎牛) )血清培养液。血清培养液。 吸管、离心管、吸管、离心管、2ml2ml冻存管（如质量不好，冻存管（如质量不好，有时密封不严，使用时炸裂；因而使用前要有时密封不严，使用时炸裂；因而使用前要仔细检查）。仔细检查）。 酒精灯（或其他安瓶封口设备）酒精灯（或其他安瓶封口设备） 、封口胶、封口胶等。等。 冻存液冻存液: : DMSODMSO液液 ： 1010DMSO 1DMSO 1双抗（过滤）双抗（过滤） 4040小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 4848（5858）基础培养液）基础培养液( (无菌无菌) ) 1

40、1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 ( (无菌无菌) ) 无色新鲜甘油（无色新鲜甘油（1 1磅蒸汽高压消毒）磅蒸汽高压消毒）三、操作步骤三、操作步骤 （图）（1 1）取生长状态好的细胞即选择对数）取生长状态好的细胞即选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存。生长期细胞，已经长满的细胞冻存。（2 2）离心洗涤）离心洗涤 用胰蛋白酶把单层生长的细用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管加入基础培养液并计数，离心加入基础培养液并计数，离心 1000 rpm1

41、000 rpmminmin2 min2 min。去除胰蛋白酶及旧的培养液。去除胰蛋白酶及旧的培养液。（3 3）加含）加含1010DMSODMSO冻存液冻存液 加入配制好加入配制好的冻存培养液（含的冻存培养液（含1010DMSODMSO或甘油），或甘油），冻存液中细胞的最终密度为冻存液中细胞的最终密度为1 15 5 10106 6mlml左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管或安瓶中，每只然后分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或冻存管加液安瓶或冻存管加液l l1 15ml5ml。（4 4）冻存管用封口胶膜封口，同时注意冻存管）冻存管用封口胶膜封口，同

42、时注意冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或支架同时作好记录。支架同时作好记录。 (5(5）封好的冻存管即可直接冻存）封好的冻存管即可直接冻存 标准的冻存标准的冻存程序为降温速率程序为降温速率l l22minmin；当温度达；当温度达2525以下时，可增至以下时，可增至5 51010minmin；到；到100100时，则可迅速浸入液氮中。时，则可迅速浸入液氮中。 要适当掌握降温速度。各种细胞对冷冻的要适当掌握降温速度。各种细胞对冷冻的耐受性不同，一般来讲上皮细胞和成纤

43、维细耐受性不同，一般来讲上皮细胞和成纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以不超过胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以不超过2 233minmin合适；而胚胎细胞耐受性最合适；而胚胎细胞耐受性最小。总之，在开始时温度下降速度不能超过小。总之，在开始时温度下降速度不能超过1010minmin。要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷冻速备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷冻速率：率：首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置44冰箱冰箱中中2 23h,3h,然后再放入然后再放入-20-20冰箱中冰箱中

44、2 23h,3h,最后置最后置7070冰箱中，经过冰箱中，经过2h 2h 8h8h左右后，取出冻存左右后，取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。作以免冻伤。（6 6）记录记录PC-3ECVLNCaPLNCaPCHO80以上sp20sp20HL-60 HL-60悬浮细胞的传代培养悬浮细胞的传代培养一、材料和试剂一、材料和试剂 HL-60HL-60细胞细胞、SP20SP20细胞细胞 RPMI1640RPMI1640生长液生长液 培养瓶、无菌吸液管（培养瓶、无菌吸液管（5ml5ml、1ml1ml）、弯头）、弯头 毛细滴管、废液缸等毛细滴管、废液缸等二、操作步骤二、操作步骤 选生长良好的选生长良好的HL-60HL-60细胞一瓶细胞一瓶 轻轻加入等量轻轻加入等量的生长液。的生长液。 用无菌吸液管轻轻吹打，使用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60HL-60细胞均匀细胞均匀悬浮悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。瓶中。 375375CO2CO2孵箱中培养孵箱中培养242448h48h。 如果细胞比较浓，可按如果细胞比较浓，可按1:31:3分配传代培养。分配传代培养。 442 2 3h3h冰箱冰箱弃上清弃上清混匀混匀HeLa4