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1、实用细胞培养技术实用细胞培养技术 在细胞培养中注意的一些问题在细胞培养中注意的一些问题 细胞培养的实验程序细胞培养的实验程序 细胞的复苏细胞的复苏 细胞的计数细胞的计数 细胞细胞(贴壁贴壁)的传代培养的传代培养 细胞的冻存细胞的冻存 悬浮细胞的培养方法悬浮细胞的培养方法 （2)2)塑料器皿塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干，塑料器皿经冲净后，晾干，用用2 2NaOHNaOH浸泡过夜，自来水冲洗，浸泡过夜，自来水冲洗，5 5盐酸浸盐酸浸泡泡30min30min，流水彻底冲洗，流水彻底冲洗3-53-5遍，单蒸馏水漂洗遍，单蒸馏水漂洗3 3遍，三（双）蒸水漂洗遍，三（双）蒸水漂洗2 2遍，烘干备用。针
2、头式遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸液滤器不能泡酸液,用用2 2NaOHNaOH泡泡6 61212小时小时,或者或者煮沸煮沸2020分钟分钟,常规冲洗干净，烘干（常规冲洗干净，烘干（6060以下）以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上时注意光面朝上(凹向上凹向上)，然后用注射器回抽，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微 拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时层用纸包装备用。注意在超净台内取出使
3、用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用洗干净烘干后，用2 2氢氧化钠溶液煮沸氢氧化钠溶液煮沸3030分钟分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理处理3030钟），自来水洗净，烘干然后再泡入钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1 1稀盐酸液中稀盐酸液中3030分钟，用自来水彻底冲洗分钟，用自来水彻底冲洗3-53-5遍，遍，蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗3 3遍，三（双）蒸漂洗遍，三（双）蒸漂洗2 2遍，烘干备遍，烘干备用。用。2.2.包装：包装：在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及在消毒前必须进行严格
4、包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。消毒日期等。3.3.消毒消毒:在组织细胞培养技术中，务必保证组织细在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。染）来完成。（1 1）消毒灭菌的方法）消毒灭菌的方法:物理
5、方法物理方法:湿热（高压蒸汽）、干热、湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物去除微生物.化学方法化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。杀灭微生物。(2)(2)消毒灭菌的时间：消毒灭菌的时间：干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160160，保持，保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。消毒方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生然进入，影响
6、消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。意外事故。湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒，要求是：消毒，要求是：不能装太满，保持消毒器内气体流通。不能装太满，保持消毒器内气体流通。在加热升压之前，打开排气阀门，使加在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。热后消毒器内的残留冷空气排出。关闭排气关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。始记录时间，并控制压力恒定。一般物品：布类、金属器械、玻璃器一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是皿等消毒的要求是 15
7、15磅磅20 min20 min；常规使用液；常规使用液体：消毒体：消毒 15 15磅磅 15 min 15 min。橡胶和塑料用品。橡胶和塑料用品 ：如滤器、：如滤器、EPEP管、离心管等高压管、离心管等高压1010磅磅15 min15 min。紫外线消毒：紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空主要用于实验室房间里的空气、操作气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为30min30min2h2h左右。左右。过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用适用于组织细胞培养使用的液体的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体
8、等。质具有生物活性的液体等。4.4.细胞培养用液及培养基（液）细胞培养用液及培养基（液）:（1 1）水：）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。双蒸水、三蒸水，可高压除菌。（2 2）平衡盐溶液（）平衡盐溶液（PBS)PBS)：PHPH为为7.27.27.47.4，不，不含钙镁离子含钙镁离子 ，可高压除菌。，可高压除菌。（3 3）消化液）消化液 ：胰蛋白酶液：胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为常用胰蛋白酶的浓度为0 025 25，pHpH值值7.27.2左右。需过滤除菌。左右。需过滤除菌。EDTAEDTA液液：常常用用浓浓度度为为 0 00202，配配制制时时采采用用无无CaCa2+2+、MgMg2+2
9、+平平衡衡盐盐液液溶溶解解，高高压压灭灭菌菌后即可使用。后即可使用。胰胰蛋蛋白白酶酶EDTAEDTANa2:Na2:需需过过滤滤除除菌菌。胰胰蛋蛋白白酶酶和和EDTANaEDTANa2 2联联合合使使用用可可提提高高消消化化率率，但但需需注注意意EDTAEDTA不不能能被被血血清清中中和和，消消化化后后要要彻底清洗，否则细胞易脱壁。彻底清洗，否则细胞易脱壁。胶原酶：胶原酶：适于消化分离纤维性组织、适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用分分离而不受损害。可用BSSBSS或含血清或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时的
10、培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。提高细胞成活率。但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为成本。胶原酶的常用剂量为 200 U 200 Umlml（约为（约为 lmg lmgmlml）或）或 0 003030 03 3。(4)(4)培养基（液）过滤除菌培养基（液）过滤除菌 常用常用0 022pm22pm微孔滤膜。微孔滤膜。（4 4）l640l640培养液培养液(常用常用)（5 5）DMEMDMEM、F12F12培养液培养液 （6 6）HamHam培养液培养液 (无血清培养中常用的无血清培养中常用的基础培养基基础培养基)（7
11、7）HepesHepes：具有较强的缓冲能力，能具有较强的缓冲能力，能常时间恒定缓冲液的常时间恒定缓冲液的PHPH值。使用浓度可根值。使用浓度可根据缓冲要求而定。据缓冲要求而定。（8 8）3%L-3%L-谷氨酰胺：谷氨酰胺：可作为细胞能量来源，可作为细胞能量来源，使用量使用量1 1。但其在溶液中极不稳定，需重新加。但其在溶液中极不稳定，需重新加入。入。（9 9）丙酮酸钠、葡萄糖：）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。成分，是细胞生命的能量来源。（1010）抗抗生生素素：最最终终浓浓度度为为青青霉霉素素 100 100 U Umlml，链链霉霉素素100
12、U100Umlml（青青霉霉素素为为8080万万U U瓶瓶，将将其其溶溶解解于于4ml4ml三三蒸蒸水水中中，每每升升培培养养液液中中加加入入0.5ml0.5ml；链链霉霉素素为为100100万万U U瓶瓶，将将其其溶溶解解在在5ml5ml三三蒸蒸水水中，每升培养液加中，每升培养液加0.5ml0.5ml）。）。（1111）细胞生长液：）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：的液体。其是配方：基础培养基基础培养基 80 809090 血清血清 10 102020 双抗双抗 100u/ml 100u/ml（1212）细胞维持液：）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长
13、或用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方：不死的培养液。其是配方：基础培养基基础培养基 95 95 血清血清 2 25 5 双抗双抗100u/ml 100u/ml（1313）冻存液：）冻存液：其是配方：其是配方：10 10DMSO DMSO 40 40小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS）1 1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 1 1双抗双抗 48 48（5858）基础培养液。）基础培养液。（1414）MEMMEM培养液培养液:其是配方：其是配方：63%MEM 63%MEM液液 20 20的乳蛋白水解物的乳蛋白水解物 10 10的小牛血清的小牛血清 1 1的双抗（的双抗（P
14、 P、S S）用用5.65.6NaHCONaHCO3 3溶液调溶液调pHpH至至7.27.27.47.4。细胞培养的实验程序细胞培养的实验程序细胞培养细胞培养动物组织原代培养动物组织原代培养 细胞株的体外培养细胞株的体外培养血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内 细胞株贮存在液氮灌或细胞株贮存在液氮灌或8080细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、以下的低温冰箱中以下的低温冰箱中 肿瘤等组织肿瘤等组织分离分离 复苏复苏组织切成组织切成1cm1cm3 3小块，方法根据样本而异。小块，方法根据样本而异。细胞复苏时速度要快，立即放入细胞复苏时速度要快，立即
15、放入有机械分散法、剪切分离法、消化分离法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法 37 37 水浴箱中充分溶解，立即水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分离法、胶原酶法（胰酶消化分离法、胶原酶法 ）离心离心500500 1000r/min1 1000r/min1 2min 2min，弃掉上清液。弃掉上清液。获得细胞悬液种入获得细胞悬液种入 接种入瓶中培养接种入瓶中培养培养瓶中培养培养瓶中培养 3737培养箱（或培养箱（或5%CO5%CO2 2培养箱）中培养培养箱）中培养2424小时后换液小时后换液去处对细胞生长有毒物质，如去处对细胞生长有毒物质，如DMSODMSO、细胞组织残渣、细胞代谢产物、细胞组织
16、残渣、细胞代谢产物 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞直接去掉上清液直接去掉上清液 离心去掉上清液，必要时做细胞饲离心去掉上清液，必要时做细胞饲养层以净化细胞养层以净化细胞 传代传代 细胞生长细胞生长8080以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异，以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异，2 23 3天或天或1 1周左右一代周左右一代 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞.消化法，用胰酶消化法，用胰酶EDTANa2EDTANa2消化，消化，直接吹打或离心法、自然沉淀法，直接吹打或离心法、自然沉淀法，时间根据细胞而定时间根据细胞而定 吸一半液到另一瓶吸一半液到另一瓶冻存冻存冻存程序冻存程序
17、细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。取对数生长期的细胞（取对数生长期的细胞（2 25 1O5 1O5 5cellscellsmlml），收集细胞前），收集细胞前24h24h换液；换液；吸吸出出培培养养液液，用用PBSPBS洗洗细细胞胞一一次次，除除去去，加加入入消消化化液液胰胰蛋蛋白白酶酶EDTANaEDTANa2 2（消消化化时时间间根根据据细细胞胞而而定定），去去掉掉消消化化液液，加加入入培培养养液液充充分分混匀，混匀，1000rp1000rp离心离心1min,1min,去掉上清液；去掉上清液；重悬浮于冻存液中，大约重悬浮于冻存液中，大约
18、1 15 105 106 6cellscellsmlml；每个冻存管中加入每个冻存管中加入lmllml细胞悬浮液，拧紧盖子。细胞悬浮液，拧紧盖子。冷冷冻冻细细胞胞应应缓缓慢慢降降温温，可可用用装装有有异异丙丙醇醇的的冷冷冻冻盒盒30min 30min 1h1h后后,再再放放入入-20-200 0C C冰冰箱箱中中2h2h左左右右，然然后后转转至至-80-800 0C C冰冰箱箱，可可保保存存数数月月，如如需长期保存，应在需长期保存，应在-80-800 0C C冰箱中放冰箱中放3h 3h 8h8h后转至液氮中。后转至液氮中。细胞计数细胞计数 一、原理一、原理 细胞计数结果以细胞数细胞计数结果以细
19、胞数/毫升表示。毫升表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活细胞活力力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。果。用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与
20、特定的试剂发生显胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂二、仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、普通显微镜、血球计数板、EPEP管、毛细吸管等。管、毛细吸管等。2 2、试剂、试剂：SP20SP20细胞、细胞、0.4 0.4台盼（酚）兰其台盼（酚）兰其配方是：台盼（酚）兰配方是：台盼（酚）兰 0.4g 0.4g加双蒸水加双蒸水100ml100ml等。等。3 3、材料：、材料：细胞悬液细胞悬液细胞悬液的制备：细胞悬液的制备：用用毛毛吸吸管管吸吸5 5滴滴细细胞胞悬悬液
21、液到到EPEP管管中中，加加入入1 1滴滴0.40.4台台盼盼蓝蓝染染液液或或苯苯胺胺黑黑，混混匀匀，静静置置2 23min,3min,活活细细胞胞不不会会被被染染色色，而而死死细细胞胞着着蓝蓝色色，这这样样加加入入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。三、三、操作步骤操作步骤 1 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。并将盖片盖在计数板上。2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。使悬液充满盖片和计数板之间。3 3、静
22、置、静置3 3分钟。分钟。4 4、镜下观察，计算计数板四个大、镜下观察，计算计数板四个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （四个大格子四个大格子细胞数细胞数/4)/4)稀释倍数稀释倍数10104 4/ml/ml 四、细胞计数要点：四、细胞计数要点：1.1.要求悬液中细胞数目不低于要求悬液中细胞数目不低于10104 4个个/ml/ml，如，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；液中；2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，
23、否则要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。影响计数准确性。3.3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；求计数准确；4.4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。5 5.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下
24、线，只计左线，不线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。计右线。体外细胞的复苏与培养体外细胞的复苏与培养概述概述复复苏苏细细胞胞与与冻冻存存的的要要求求相相反反，应应采采用用快快速速融融化化的的手手段段。这这样样可可以以保保证证细细胞胞外外结结晶晶在在很很短短的的时时间间内内即即融融化化。避避免免由由于于缓缓慢慢融融化化使使水水分分渗渗入入细细胞胞内内形形成成胞胞内内再再结结晶晶对对细细胞胞造造成成损害。损害。用品和试剂用品和试剂培培 养养 液液、吸吸 管管、离离 心心 管管、培培 养养 瓶瓶、CHOCHO/Hela/Hela细胞等。细胞等。操作步骤操作步骤（图）（图）注注 意意 存
25、存取取冻冻存存管管时时都都要要佩佩戴戴防防护护眼眼镜镜和和手手套套，冻冻存存管管投投入入存存放放温温水水的的器器皿皿中中后后应应立立即即把把盖盖子子扣上，以防发生意外。扣上，以防发生意外。离心后上清夜一定要吸干净，以免因离心后上清夜一定要吸干净，以免因DSMODSMO的毒性造成细胞活力下降而难以复活。的毒性造成细胞活力下降而难以复活。细胞传代培养细胞传代培养一、原理一、原理在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行续生长，同时也将细胞数量扩大，就
26、必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材料和试剂二、材料和试剂 细胞：贴壁细胞株细胞：贴壁细胞株CHOCHO 试剂：试剂：0.250.25胰酶、胰酶、16401640培养基（含培养基（含1010小牛血清）。小牛血清）。仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等。瓶、吸管
27、、废液缸等。三、操作步骤三、操作步骤 将将长满长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。加入加入0.50.51ml 0.251ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。胞都浸入溶液中。瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml10ml培养液终培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室
28、温发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为消化时间约为1 13 3分钟。分钟。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖），置外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖），置3737下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。四、注意事项四、注意事项 形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。长。传代时不
29、同的细胞消化时间不同，因而要传代时不同的细胞消化时间不同，因而要根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。吹打吹打细细胞胞时动时动作要作要轻轻巧尽可能减少巧尽可能减少对细对细胞的胞的损伤损伤。防止由于培养防止由于培养细细胞胞污污染等因素造成染等因素造成细细胞系的胞系的绝绝种种，要及时冻存细胞。，要及时冻存细胞。细细胞档案要胞档案要记录记录好，如好，如组织组织来源，生物学特来源，生物学特性，培养液要求、性，培养液要求、传传代、代、换换液液时间时间和和规规律，律，细细胞胞的的遗传遗
30、传学学标标志，生志，生长长形形态态，常，常规规病理染色的病理染色的标标本本等。等。附附1 116401640基础培养基配置方法基础培养基配置方法:16401640粉粉 10.4g 10.4g Hepes 2.38g Hepes 2.38g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 2.5g 丙酮酸钠丙酮酸钠 110mg NaHCO 110mg NaHCO3 3 2g 2g 双（三）蒸水加至双（三）蒸水加至1000ml1000ml附附2 2：消化液配制方法：消化液配制方法：称取称取0.25g0.25g胰酶蛋白酶（活力为胰酶蛋白酶（活力为1 1：250250），加），加100ml100ml无无CaCa2+2+、Mg
31、Mg2+2+的的HanksHanks液液(或或PBSPBS液液)溶解，溶解，滤器过滤除用前可在滤器过滤除用前可在3737下回温。胰酶溶液中下回温。胰酶溶液中也可加入也可加入EDTAEDTANaNa2 2，使最终浓度达，使最终浓度达0.020.02。细胞的冻存细胞的冻存一、概述一、概述冻冻存存细细胞胞时时要要缓缓慢慢冷冷冻冻。因因为为细细胞胞在在直直接接冷冷冻冻时时，细细胞胞内内外外的的水水分分都都会会很很快快形形成成冰冰晶晶，冰冰晶晶的的形形成成将将引引起起一一系系列列的的不不良良反反应应。首首先先细细胞胞脱脱水水,部部分分蛋蛋白白质质由由于于上上述述因因素素而而变变性性，引引起起细细胞胞内内
32、部部空空间间结结构构紊紊乱乱，细细胞胞内内冰冰晶晶的的形形成成和和细细胞胞膜膜系系统统上上蛋蛋白白质质、酶酶的的变变性性，引起细胞能量代谢的障碍。引起细胞能量代谢的障碍。细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内胞核内DNADNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成积膨胀造成DNADNA的空间构型发生不可逆的损伤性的空间构型发生不可逆的损伤性变
33、化，而引起细胞的死亡。因此在细胞冻存时要变化，而引起细胞的死亡。因此在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。晶的形成是减少细胞损伤的关键。目目前前多多采采用用甘甘油油或或二二甲甲基基亚亚砜砜作作保保护护剂剂。这这两两种种物物质质分分子子量量小小，溶溶解解度度大大，易易穿穿透透细细胞胞，可可以以使使冰冰点点下下降降，提提高高胞胞膜膜对对水水的的通通透透性性；加加上上缓缓慢慢冷冷冻冻方方法法可可使使细细胞胞内内的的水水分分渗渗出出细细胞胞外外，在在胞胞外外形形成成冰冰晶晶，减减少少细细胞胞内内冰冰晶晶的的形形成
34、成，从从而而减减少少由由于于冰冰晶晶形形成成所所造造成成的的细细胞胞损损伤伤。这这样样可以最大限度的保存细胞活力。可以最大限度的保存细胞活力。二、用品和试剂二、用品和试剂 0.25 0.25胰蛋白酶。胰蛋白酶。含含10102020(胎牛胎牛)血清培养液。血清培养液。吸吸管管、离离心心管管、2ml2ml冻冻存存管管（如如质质量量不不好好，有有时时密密封封不不严严，使使用用时时炸炸裂裂；因因而而使使用用前前要要仔细检查）。仔细检查）。酒酒精精灯灯（或或其其他他安安瓶瓶封封口口设设备备）、封封口口胶胶等。等。冻存液冻存液:DMSODMSO液液 ：10 10DMSO 1DMSO 1双抗（过滤）双抗（过
35、滤）40 40小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS）48 48（5858）基础培养液）基础培养液(无菌无菌)1 1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3(无菌无菌)无色新鲜甘油（无色新鲜甘油（1 1磅蒸汽高压消毒）磅蒸汽高压消毒）三、操作步骤三、操作步骤（图）（1 1）取取生生长长状状态态好好的的细细胞胞即即选选择择对对数数生长期细胞，已经长满的细胞冻存。生长期细胞，已经长满的细胞冻存。（2 2）离心洗涤）离心洗涤 用胰蛋白酶把单层生长的细用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管依据传代方
36、法把消化好的细胞收集于离心管加入基础培养液并计数，离心加入基础培养液并计数，离心 1000 rpm 1000 rpmmin2 minmin2 min。去除胰蛋白酶及旧的培养液。去除胰蛋白酶及旧的培养液。（3 3）加含）加含1010DMSODMSO冻存液冻存液 加入配制好加入配制好的冻存培养液（含的冻存培养液（含1010DMSODMSO或甘油），冻或甘油），冻存液中细胞的最终密度为存液中细胞的最终密度为1 15 105 106 6mlml左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或冻存管加液冻存管
37、加液l l1 15ml5ml。（4 4）冻存管用封口胶膜封口，同时注意冻存管）冻存管用封口胶膜封口，同时注意冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或支架同时作好记录。支架同时作好记录。(5(5）封好的冻存管即可直接冻存）封好的冻存管即可直接冻存 标准的冻存标准的冻存程序为降温速率程序为降温速率ll22minmin；当温度达；当温度达2525以下时，可增至以下时，可增至551010minmin；到；到100100时，则可迅速浸入液氮中。时，则可迅速浸入液氮中。要要适适当当
38、掌掌握握降降温温速速度度。各各种种细细胞胞对对冷冷冻冻的的耐耐受受性性不不同同，一一般般来来讲讲上上皮皮细细胞胞和和成成纤纤维维细细胞胞耐耐受受性性大大；骨骨髓髓细细胞胞差差一一些些，以以不不超超过过2233minmin合合适适；而而胚胚胎胎细细胞胞耐耐受受性性最最小小。总总之之，在在开开始始时时温温度度下下降降速速度度不不能能超超过过1010minmin。要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷冻速备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷冻速率：率：首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置
39、44冰箱冰箱中中2 23h,3h,然后再放入然后再放入-20-20冰箱中冰箱中2 23h,3h,最后置最后置7070冰箱中，经过冰箱中，经过2h 2h 8h8h左右后，取出冻存左右后，取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。作以免冻伤。（6 6）记录记录PC-3ECVLNCaPLNCaPCHO80以上sp20sp20HL-60 HL-60悬浮细胞的传代培养悬浮细胞的传代培养一、材料和试剂一、材料和试剂 HL-60HL-60细胞细胞、SP20SP20细胞细胞 RPMI1640RPMI1640生长液生长液 培养瓶、无菌吸液管（培养瓶、
40、无菌吸液管（5ml5ml、1ml1ml）、弯头）、弯头 毛细滴管、废液缸等毛细滴管、废液缸等二、操作步骤二、操作步骤 选生长良好的选生长良好的HL-60HL-60细胞一瓶细胞一瓶 轻轻加入等量轻轻加入等量的生长液。的生长液。用无菌吸液管轻轻吹打，使用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60HL-60细胞均匀细胞均匀悬浮悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。瓶中。375 375CO2CO2孵箱中培养孵箱中培养242448h48h。如果细胞比较浓，可按如果细胞比较浓，可按1:31:3分配传代培养。分配传代培养。442 2 3h 3h冰箱冰箱弃上清弃上清混匀混匀