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1、DNA的提取及鉴定的提取及鉴定一、动物肝脏中动物肝脏中DNA的提取的提取一一 . 实验目的实验目的 学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术 了解分离提取DNA的一般原理DNA的主要来源的主要来源1.动物组织及器官：脾、肝、胸腺、鱼类精子等。2.植物：种子的胚芽等3.微生物：细菌、酵母菌等 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。核酸提取的主要步骤：核酸提取的主要步骤：1.破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声波、冻融；一硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）2.除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白质
2、变性（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤3.除去其他不需要的核酸分子4.沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的
3、溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。 二二 .实验原理实验原理 将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿氯仿-异丙醇异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸 (EDTA)。大部分多糖在用乙醇或
4、异丙醇分级沉淀时即可除去。 DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应蓝色反应。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占优势， DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有机溶剂。用络合剂EDTA抑制核酸水解酶的活力, 同时用去污剂SDS把蛋白质和DNA分开,再用氯仿-异丙醇作为蛋白质的变性剂沉淀蛋白质, 最后用乙醇把DNA沉淀出来。三、提取三、提取DNA的注意
5、事项的注意事项1.避免过酸、过碱及高温2.加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等3.蛋白变性剂反映不宜过于剧烈，以防机械张力使核酸链破坏。4.加入RNA降解酶除RNA5.操作迅速四、实验器材四、实验器材 1. 捣碎机 2. 离心机 3. 手术剪 4. 离心管 5. 刻度吸管 6. 烧杯（100ml，250ml） 7. 玻棒 8. 新鲜动物肝脏 9.石英比色皿 10.量筒（10ml，100ml） 11.容量瓶（50ml）五、五、 实验试剂实验试剂 1、0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）。 2、0.015mol/LNaCl-0.00
6、15mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828克及柠檬酸三钠0.341克溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3、95%乙醇（A.R.）。 4、NaCl固体（A.R.）。 5、5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。 6、氯仿（A.R.）。 7、V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1六、实验操作六、实验操作1）粗提）粗提 1称取猪肝8g于100ml的小烧杯中，用剪刀剪碎，加入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（16ml），高速匀浆。 2将匀浆液（25ml）转移到100ml离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去上清液。沉淀中继续加入25ml缓冲液，
7、搅拌均匀后于4000r/min离心20min，取沉淀。2）分离）分离DNP、除蛋白、除蛋白 3将上述沉淀转移至250ml烧杯中，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、21ml氯仿/异戊醇、4ml5%SDS，用保鲜膜封口，振摇30min。 4缓慢加入3.6gNaCl（事先在研钵中研成粉末）使体系终浓度为1mol/L。将混合液转移至离心管中于3500r/min离心20min，取上清水相（用滴管吸取并量体积）。3）沉淀）沉淀DNA 5在水相中加入等体积95%乙醇，边加边用玻璃棒朝一个方向慢慢搅动直至溶液澄清，将DNA凝胶缠绕在玻璃棒上，用滤纸吸去多余的乙醇，得DNA
8、粗品。【注】用玻棒缠绕DNA有困难时，亦可缓慢摇动烧杯以助于DNA聚集。 6将DNA粗品用5mmol/L NaOH溶解并定容至50ml，作为待测样品。DNA鉴定或定量（二苯胺法）： 颜色反应可先完成标准曲线的制作，或配置一个标准管。CECS 694-02 Introduction to Bioinformatics University of Louisville Spring 2004 Dr. Eric Rouchka( (二二) )二苯胺法测定二苯胺法测定DNADNA含量含量二、原理二、原理 核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对分别针
9、对DNADNA和和RNARNA的颜色反应方法的颜色反应方法 本实验采用针对本实验采用针对DNADNA的二苯胺法测的二苯胺法测DNADNA的含量。在的含量。在酸性溶液中，酸性溶液中，DNADNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在物质在595nm595nm有最大吸收，在有最大吸收，在4040400mg/mL400mg/mL范围内其范围内其峰值与峰值与DNADNA含量成正比含量成正比 NH100冰醋酸，少量硫酸蓝色物蓝色物DNA + DNA鉴定或定量（二苯胺法）： 空白管 标准管 测定管标准DNA溶液 0 1.0 待测样品溶液 1.0蒸馏水 2.0 1.0 1.0二苯胺试剂 4.0 4.0 4.060C水浴30-40min，冷却，595nm比色。计算：C测=C标*A测/A标 w=C测*50ml/8g (DNA g/g 样品) 七、注意事项七、注意事项1、匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。2、固体NaCl应磨碎，加入应分批慢慢加入，且边加边摇，避免局部浓度过大或未及溶解而沉入氯仿层。3、变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。 4、实验结束后将变性蛋白质（肝糜）小心取出置于专用废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。