DNA提取与鉴定ppt课件.ppt

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1、“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。实验指导老师实验指导老师 刘晓颖刘晓颖 张萍萍张萍萍 陈彦陈彦 王剑峰王剑峰 李绍飞李绍飞 2012-02生物化学大实验生物化学大实验“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。生物化学大实验生物化学大实验 实验一：动物基因组的制备及其鉴定1 实验二：动物基因组的制备及其鉴定2 实验三：动物基因组的制备及其鉴定

2、3 实验四：糖类化合物的提取及TLC分析1 实验五：糖类化合物的提取及TLC分析2 实验六：Sephadex-G50层析法分离蛋白质 实验七：SDS-PAGE测定蛋白质分子量 实验八：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。生物化学大实验生物化学大实验 实验一：动物基因组的制备及其鉴定1 实验二：动物基因组的制备及其鉴定2 实验三：动物基因组的制备及其鉴定3 实验四：糖的分离鉴定硅胶G薄层层析 实验五：Sephadex-G5

3、0层析法分离蛋白质 实验六：蛋白质的FPLC分离与定量测定“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。实验要求（1）实验前要预习相关的内容实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。（2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序。如实记录实验中出现的现象和数据。（3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。（4）实验报告要及时完成。报

4、告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及实验中需要改进的地方进行讨论。（5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求的除外。（6）试剂(特别是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管

5、理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。成绩评定成绩评定 平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报告等 70 60% 期末理论考试： 30 40%“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。动物组织的动物组织的提取与鉴定提取与鉴定 刘晓颖刘晓颖 张萍萍张萍萍“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。分离纯化核酸原则与要求分离纯化

6、核酸原则与要求1. 1.应保证核酸一级结构的完整性应保证核酸一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求要求) ) 2.2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度； 无其他核酸分子的污染，例如提取无其他核酸分子的污染，例如提取DNADNA分子时，应去分子时，应去除

7、除RNARNA分子分子3.3.减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解 避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在作多在pH 4pH 41010条件下进行条件下进行“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。4. 4. 减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解 强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都反复冻

8、贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性能明显破坏大分子量的线性DNADNA分子对于分子量小分子对于分子量小的环状质粒的环状质粒DNADNA及及RNARNA分子，威胁相对小一些分子，威胁相对小一些 。5. 5. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。酸的一级结构。DNADNA酶需要酶需要MgMg2+2+，CaCa2+2+的激活，因此的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTAEDTA，柠檬酸盐，柠檬酸盐，可基本抑制可基本抑制D

9、NADNA酶的活性酶的活性 RNARNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是碱，不易失去活性，所以生物降解是RNARNA提取过程的提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一液氮或一7070的冰箱中。的冰箱中。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治

10、安防控工程”。DNADNA在细胞内的分布在细胞内的分布核酸包括核酸包括DNADNA、RNARNA两种分子，在细胞中两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体真核生物的染色体DNADNA为双链线性分子，原为双链线性分子，原核生物的染色体核生物的染色体DNADNA、质粒及真核细胞器、质粒及真核细胞器DNADNA为双链环状分子；有些噬菌体为双链环状分子；有些噬菌体DNADNA为单为单链环状分子；链环状分子；“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众

11、性治安防控工程”。 9595的真核生物的真核生物DNADNA主要存在于细胞核内，主要存在于细胞核内，其他其他5 5为为细胞器细胞器DNADNA，如线粒体、叶绿体等，如线粒体、叶绿体等 RNARNA分子主要存在于细胞质中，约占分子主要存在于细胞质中，约占7575，另有，另有1010在细胞核中，在细胞核中，1515在细胞器中。在细胞器中。 大多数生物体内大多数生物体内RNARNA分子均为单链线性分子并具有不同分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物的结构特点，如真核生物mRNAmRNA分子多数在分子多数在3 3端带有端带有polyApolyA结构。结构。 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇

12、）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。DNADNA的性质的性质 DNADNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使堆积力而进一步加强，使DNADNA在细胞内比其他成分更在细胞内比其他成分更具化学耐久性。具化学耐久性。 因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNADNA分子仍然稳定。分子仍然稳定。 真核生物中的染

13、色体真核生物中的染色体DNADNA与碱性蛋白与碱性蛋白( (组蛋白组蛋白) )结合而结合而成核蛋白成核蛋白(DNP)(DNP)形式而存在于核内。形式而存在于核内。DNPDNP溶于水和浓溶于水和浓盐溶液盐溶液(1-2mol/L (1-2mol/L 氯化钠氯化钠) )，但不溶于生理盐溶液中，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L (0.14mol/L 氯化钠氯化钠) )，而，而RNPRNP此时的溶解度较大，因此此时的溶解度较大，因此可利用这一性质，将可利用这一性质，将DNPDNP与与RNPRNP分离。分离。 DNADNA在乙醇中形成絮状沉淀，使在乙醇中形成絮状沉淀，使DNADNA最终得以分离最终

14、得以分离“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。真核生物基因组真核生物基因组DNADNA分离纯化的基本步骤分离纯化的基本步骤 真核生物的一切有核细胞真核生物的一切有核细胞( (包括培养细胞包括培养细胞) )都可都可以用来制备基因组以用来制备基因组DNADNA。提取方法包括两步：。提取方法包括两步： 1 1、先温和裂解细胞及溶解、先温和裂解细胞及溶解DNPDNP，而后使，而后使DNPDNP与与RNPRNP分离，再使核蛋白解离，释放出分离，再使核蛋白解离，释放出DNA.DN

15、A. 真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K K和去污剂和去污剂温和处理法，为获得大分子质量的温和处理法，为获得大分子质量的DNADNA，一般多采用后者，一般多采用后者温和裂解细胞。温和裂解细胞。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。高分子质量高分子质量DNADNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而

16、弯曲的而弯曲的DNADNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸 基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNADNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于难度也相应增加，大于150 kb150 kb的的DNADNA分子在常规分离分子在常规分离方法中多被切断。方法中多被切断。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提

17、操作对DNADNA链机械剪切机会较多，因此有人使用链机械剪切机会较多，因此有人使用8080甲酰胺解聚甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得小于核蛋白联合透析的方法，可得小于200 kb200 kb的的DNADNA片段。片段。2. 2. 采用化学或酶学方法去除蛋白质、采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNARNA及其及其他大分子他大分子“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。猪脾脏猪脾脏DNADNA提取与鉴定提取与鉴定【实验目的实验目的】掌握浓盐法提取与鉴定动物组织掌握浓盐法提

18、取与鉴定动物组织DNADNA的原的原理和方法。理和方法。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。【实验原理实验原理】 核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。在细胞内，在细胞内，RNARNA与蛋白质结合成核糖核蛋白与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNPRNP），），DNADNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DN

19、PDNP）。）。 在在.14 mol.14 molL L的氯化钠溶液中，的氯化钠溶液中， RNPRNP的溶解度相的溶解度相当大，而当大，而DNPDNP的溶解度仅为在水中溶解度的的溶解度仅为在水中溶解度的1 1；当氯化钠的浓度达到当氯化钠的浓度达到1 1 molmolL L的时候，的时候， RNPRNP的溶解的溶解度小，而度小，而DNPDNP的溶解度比在水中的溶解度大的溶解度比在水中的溶解度大2 2倍。倍。所以常选用所以常选用.14 mol.14 molL L的氯化钠溶液提取的氯化钠溶液提取RNPRNP ，而选用而选用1 1 molmolL L的氯化钠溶液提取的氯化钠溶液提取DNPDNP 。“雪

20、亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。核酸提取液中含有核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加在核酸提取液中加入氯仿入氯仿- -异戊醇或氯仿异戊醇或氯仿- -辛醇，振荡一段时间，辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在离心除去，核酸仍留在水溶液中。水溶液中。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以

21、综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNADNA或或RNARNA呈絮状沉淀析出。呈絮状沉淀析出。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。【实验材料实验材料】1 1材料材料新鲜新鲜( (冰冻冰冻) )猪脾脏。猪脾脏。2 2器材器材高速组织捣碎机，恒温水浴，台式冷冻离心机，锥形瓶，高

22、速组织捣碎机，恒温水浴，台式冷冻离心机，锥形瓶，具塞三角瓶，试管具塞三角瓶，试管3 3试剂试剂(2(2人人/ /组组) )(1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L(1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L柠檬酸钠混合液：称取柠檬酸钠混合液：称取0.58g 0.58g NaClNaCl和和1.47g1.47g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至100mL100mL。(2) 10(2) 10(1.71mol/L)NaCl(1.71mol/L)NaCl溶液溶液200ml200ml(3) (3) 氯仿氯仿: :异戊醇异戊醇(24:l ,V/V)

23、(24:l ,V/V)，现用现配（通风橱中）。，现用现配（通风橱中）。 (4) 95(4) 95乙醇乙醇 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。【实验方法实验方法】1 1取新鲜取新鲜( (冰冻冰冻) )猪脾脏猪脾脏20g20g，剔去结缔组织，用，剔去结缔组织，用0.1mol/L 0.1mol/L NaCl-0.05mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪柠檬酸溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。成碎末。2 2加入加入2 2倍组织重的倍组

24、织重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠混柠檬酸钠混合液合液(40mL)(40mL)置高速组织捣碎机内破碎细胞膜置高速组织捣碎机内破碎细胞膜( (慢档，每慢档，每次次5s5s，间隔，间隔30s30s，共绞，共绞3 3次次) )，获得组织浆液。，获得组织浆液。静置静置5min5min，期间轻轻搅拌以充分释放期间轻轻搅拌以充分释放RNARNA。3 3组织浆液于组织浆液于4 43500r/min3500r/min离心离心20min20min，弃去上层液，收，弃去上层液，收集沉淀集沉淀( (包括细胞核包括细胞核) )。4 4向细胞核沉淀

25、中加入向细胞核沉淀中加入6 6倍组织重的倍组织重的1010(1.71mol/L)NaCl(1.71mol/L)NaCl溶液溶液120mL120mL，充分搅匀，置冰箱内过夜。，充分搅匀，置冰箱内过夜。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。【实验方法实验方法】5 5次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入( (线状、线状、缓慢倒入缓慢倒入) ) 预冷的预冷的1111倍体积倍体积(1320mL)(1320mL)蒸馏水中，轻轻蒸馏水中，轻轻

26、摇匀，摇匀，DNPDNP即呈絮状沉淀析出，置冰箱内放置数小即呈絮状沉淀析出，置冰箱内放置数小时。时。6 6上层清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少上层清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心量溶液经离心(3500r/min(3500r/min，15min)15min)，收集，收集DNPDNP沉淀。沉淀。7 7将将DNPDNP沉淀再溶于原组织重约沉淀再溶于原组织重约4 4倍体积倍体积(80mL)(80mL)的的1010NaClNaCl溶液中，溶液中，轻轻搅拌轻轻搅拌加速溶解，加速溶解，转移至带盖的转移至带盖的三角瓶中。三角瓶中。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心

27、为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。8 8加入加入l/2l/2体积的氯仿体积的氯仿- -异戊醇溶异戊醇溶液液(24:l ,V/V) 40mL(24:l ,V/V) 40mL，上下剧烈上下剧烈振荡振荡2-5min2-5min ，使组蛋白分离，使组蛋白分离，于于3500r/min3500r/min，离心，离心l5minl5min，吸，吸出上面含有出上面含有DNADNA和和DNPDNP的水层，的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。回收下层有机相。9 9上层水相再次加入上层水相再次加入20m

28、L20mL氯仿氯仿- -异戊醇混合液，继续抽提去除异戊醇混合液，继续抽提去除蛋白，多次重复此操作（至少蛋白，多次重复此操作（至少共共3 3次）直至两相之间无明显次）直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。变性蛋白质凝胶生成。【实验方法实验方法】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1010最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至至44的的9595乙醇中。乙醇中。1111用玻棒小心捞出纤维状用玻棒小心捞出纤维状DNADNA钠盐沉淀

29、，沥干钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用乙醇溶液后，依次用8080和和9595乙醇洗涤，最后乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维即得白色纤维DNADNA钠盐钠盐。 【实验方法实验方法】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。【注意事项注意事项】1 1为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，为了防止大分子核酸在提取过

30、程中被降解，使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加人酸。提取中需要加人柠檬酸钠柠檬酸钠、EDTAEDTA、8- 8-羟羟基喹啉等基喹啉等抑制核酸酶的活力抑制核酸酶的活力，并在，并在低温低温下进行下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和剧烈振荡等。碱和剧烈振荡等。本实验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧本实验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧烈，时间不能太长，避免部分细胞核被破坏，烈，时间不能太长，避免部分细胞核被破坏，导致导致DNADNA释放而被断裂，这将关系到最后是否释放而被断裂，这将关系

31、到最后是否能获得纤维状能获得纤维状DNADNA。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。2 2除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNADNA断裂，断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状DNADNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNADNA。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响则影响DNADNA制品的质量。制品的质

32、量。3 3细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时可能形成块状凝胶有时可能形成块状凝胶( (如以脾脏为材料制备如以脾脏为材料制备DNA)DNA)，应置捣碎机内绞，应置捣碎机内绞5s5s，打碎凝胶块，但此，打碎凝胶块，但此时时DNADNA已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打碎。已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打碎。【注意事项注意事项】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。思考题1. 1.为什么在低温下进行？为什么在低温下进行？2.

33、2.加柠檬酸钠和加柠檬酸钠和EDTAEDTA的作用的作用 ? ?3. 3.加加NaClNaCl的作用，为什么要加到的作用，为什么要加到1 1mol/L?mol/L?4. 4.加入异戊醇有什么作用？加入异戊醇有什么作用？5. 5.分离纯化过程中每一步试剂的作用？分离纯化过程中每一步试剂的作用？“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。l实验室：实验室： 315室室 313室室 311室室l领用仪器：领用仪器： 312室室 王剑峰王剑峰l纯水机：纯水机： 311室室l制冰机室

34、：制冰机室： 204室室l离心机：离心机： 313室一台，室一台，204室一台，室一台， 103室一台，室一台，101室一台，室一台，l分光光度计室：分光光度计室：206室室“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。DNA的鉴定与分析二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNADNA含量含量紫外吸收法测定紫外吸收法测定DNADNA纯度纯度琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA分子大小分子大小与完整性与完整性“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥

35、平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNADNA含量（一）含量（一） 强酸、加热条件下，可以使强酸、加热条件下，可以使DNADNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖脱氧核糖与嘧啶核苷酸。与嘧啶核苷酸。 其中其中22脱氧核糖在酸性环境中成为脱氧核糖在酸性环境中成为羟基羟基酮基戊醛，酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成此物与二苯胺反应生成蓝色化合物蓝色化合物，在，在595595nmnm处有最大吸收。处有最大吸收。DNADNA

36、在在40-40040-400g/mlg/ml范围内光密度与范围内光密度与DNADNA浓度成正比。浓度成正比。 在反应液中加入在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干，而且其他化合物的干扰也显著降低。扰也显著降低。 当样品含少量当样品含少量RNARNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。【实验原理实验原理】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公

37、共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1 1、DNADNA标准溶液：标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准（须经定磷法确定其浓度）取标准DNADNA以以0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH配成配成200200微克微克/ /毫升的标准液。毫升的标准液。 每组需每组需1212.4ml.4ml，200ml/200ml/班班2 2、待测样品液：待测样品液：准确称取猪脾准确称取猪脾DNA 5mg,DNA 5mg,用用0.010.01mol/Lmol/L的氢氧化的氢氧化钠溶液定容至钠溶液定容至50ml50ml配成配成100100微克微克/ /毫升的溶液。毫升的溶液。

38、每组需每组需7ml7ml3 3、二苯胺试剂：、二苯胺试剂：1g1g二苯胺二苯胺 （需在（需在70%70%乙醇试剂中重结晶乙醇试剂中重结晶2 2次次) ) +100 mL+100 mL冰乙酸冰乙酸+10 mL+10 mL过氯酸，混合备用，过氯酸，混合备用，临用前加入临用前加入1.0 1.0 mL1.6%mL1.6%乙醛。乙醛。 每组需每组需64ml,1000ml/64ml,1000ml/班班4 4、1.6%1.6%乙醛：乙醛：取取47%47%乙醛乙醛3.43.4mlml，加重蒸水定容至加重蒸水定容至100100mlml（放于放于冰箱中，一周之内可以使用）。冰箱中，一周之内可以使用）。注意：商品用

39、有注意：商品用有47%47%和和4 40%0%两种两种“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 1. 1. DNADNA标准曲线的制定：标准曲线的制定： 取取1 14 4支试管，分成支试管，分成2 2组，依次加入组，依次加入0 0、0.20.2、0.40.4、0.80.8、1.21.2、1.61.6和和2.02.0mlDNAmlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2 2mlml。然后各加入然后各加入4 4mlml二苯胺试剂，混匀。于沸水

40、浴中加热二苯胺试剂，混匀。于沸水浴中加热10min 10min ，冷却后于冷却后于595595nmnm处处进行比色测定。进行比色测定。取两管平均值取两管平均值，以，以DNADNA浓度为横坐标，光吸收值为浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。纵坐标，绘制标准曲线。【操作方法操作方法】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 DNADNA含量含量/g/g 0 0 4040 8080 160160 240240

41、320320 400 400 DNADNA标准溶液标准溶液mLmL 0 0 0.20.2 0.40.4 0.80.8 1.21.2 1.6 1.6 2.02.0 蒸馏水蒸馏水mLmL 2.0 2.0 1.8 1.8 1.6 1.6 1.21.2 0.80.8 0.40.4 0 0 二苯胺试剂二苯胺试剂mLmL 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0混匀，立即放入混匀，立即放入沸水浴沸水浴中中加热加热10min10min，取出后流水，取出后流水冷却冷却，冷却后，冷却后595nm595nm处比色处比色 A A595595 DNADNA标准曲

42、线的制定标准曲线的制定以以1号管为空白对照号管为空白对照“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 2. 2. 制品的测定：制品的测定： 取取2 2支试管，各加支试管，各加2 2mlml待测液（内含待测液（内含DNADNA应在标准曲应在标准曲线的范围之内）和线的范围之内）和4 4mlml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。标准曲线的制作。3.3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该

43、光吸收值光吸收值DNADNA的含量，计算出制品中的百分含量的含量，计算出制品中的百分含量。【操作方法操作方法】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。 DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= 100 待测液中制品的微克数 DNA产率: 测得的DNA的微克数 DNA%= 100 原料的微克数数据处理“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”

44、。 二苯胺试剂仅能与二苯胺试剂仅能与嘌呤核苷酸中的脱氧核糖反嘌呤核苷酸中的脱氧核糖反应应. . 因此测定的可靠性受到不同来源的因此测定的可靠性受到不同来源的DNADNA中嘌呤中嘌呤与嘧啶核苷酸比例变化的限制，为提高测定准与嘧啶核苷酸比例变化的限制，为提高测定准确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸腺腺DNADNA作为标准样品进行校正。作为标准样品进行校正。【注意事项注意事项】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。紫外吸收法测定

45、紫外吸收法测定DNADNA纯度（二）纯度（二） 核酸在核酸在260nm260nm波长处具有紫外吸收特性波长处具有紫外吸收特性( (最大吸收峰最大吸收峰) )。此法快速、。此法快速、简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯DNADNA和和RNARNA溶液溶液的首选方法。的首选方法。高纯度高纯度DNADNA制品的制品的260nm260nm与与280nm280nm的吸光值在的吸光值在1.81.8左右左右，当比值偏，当比值偏高时表明制品中混杂有高时表明制品中混杂有RNA,RNA,而比值偏低时则表明制品中可能有蛋而比值偏低时则表明制品中可能有蛋白质或酚的污染。

46、白质或酚的污染。因此，可利用因此，可利用A260/A280A260/A280比值的测定来鉴定比值的测定来鉴定DNADNA制品的纯度制品的纯度。【实验原理实验原理】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1 1吸取吸取2.5mlDNA2.5mlDNA样品，转入石英比色杯中样品，转入石英比色杯中( (若样品很少，可用若样品很少，可用0.5mL0.5mL的比色杯，上述体积均减一半的比色杯，上述体积均减一半) )。2 2用用2.5mL 2.5mL 0.010.01mol/L N

47、aOHmol/L NaOH校正紫外分光光度计的零点。校正紫外分光光度计的零点。3 3在在260nm260nm，280nm280nm处分别读出吸光度值处分别读出吸光度值(A)(A)。定量分析：定量分析：DNADNA的浓度的浓度=A260=A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数505010001000 =A260 =A2601 1505010001000 =20 =20A260(g/l)A260(g/l) RNA RNA的浓度的浓度=A260=A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40401000 (g/l)1000 (g/l)【实验步骤】 分光光度换算：分光光度换算： 1A2601A260双链双链DNA=5

48、0g/ml DNA=50g/ml 1A2601A260单链单链DNA=30g/ml DNA=30g/ml 1A2601A260单链单链RNA=40g/mlRNA=40g/ml “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。注意 将DNA样品稀释到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之间再测A260、A280及计算A260/A280比值，因为只有在此范围内才有线性关系，可先用原液测定，再估算稀释比例。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综

49、治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。4 4纯度分析：纯度分析：若为若为DNADNA纯品，则纯品，则A260A260A280=1.8A280=1.8 若为若为RNARNA纯品，则纯品，则A260A260A280=2.0A280=2.0 若若DNADNA样品样品A260A260A2801.8A2801.8，说明仍有，说明仍有RNARNA，可用，可用RNARNA酶处理酶处理样品；若样品；若A260A260A280l.7A280l.7，说明样品中存在蛋白质，应再用酚，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀纯化氯仿抽提，乙醇沉淀纯

50、化DNADNA。 若为若为RNARNA样品样品A260A260A2802.0A2802.0，也应考虑再用酚，也应考虑再用酚/ /氯仿抽提。氯仿抽提。 若核酸样品若核酸样品A260A260A2302.0A23010V/cm)(10V/cm)，所，所以选择一个有相对较大的缓冲槽比较有利。以选择一个有相对较大的缓冲槽比较有利。【注意事项注意事项】“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网