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1、DNADNA的提取及的提取及性质鉴定性质鉴定染色体成分染色体成分蛋白质蛋白质RNA(少量少量)DNA一、基本原理：一、基本原理：1 1、初步分开初步分开DNPDNP和和RNPRNP 在细胞内在细胞内DNADNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)，RNARNA与蛋白质结合成核糖核蛋白与蛋白质结合成核糖核蛋白(RNP)(RNP)，在，在不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大，不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大，DNPDNP在纯水或在纯水或1mol1molL NaClL NaCl溶液中溶解度较大，但在溶液中溶解度较大，但在0 014mol14molLNa
2、ClLNaCl溶液中溶解度很低，相反，溶液中溶解度很低，相反，RNPRNP易易溶解。因此，用溶解。因此，用0 014mol14molLNaClLNaCl溶液可简单地溶液可简单地初初步分开步分开DNPDNP和和RNPRNP。2 2、从从DNPDNP中把蛋白质去除中把蛋白质去除在分离核酸中最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，在分离核酸中最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。常用的解离剂是阴离子去垢剂，而且还要避免核酸的降解。常用的解离剂是阴离子去垢剂，如脱氧胆酸钠，如脱氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)，4 4氨基水杨酸钠和氨基水杨酸钠和萘萘1
3、 1，5 5二磺酸钠等，它们具有溶解病毒、细菌的作用，二磺酸钠等，它们具有溶解病毒、细菌的作用，可使核酸从蛋白质上游离出来，还具有抑制核糖核酸酶的作可使核酸从蛋白质上游离出来，还具有抑制核糖核酸酶的作用。用。另外除去核酸中的蛋白质的一个有效办法是用酚另外除去核酸中的蛋白质的一个有效办法是用酚氯仿混合氯仿混合液，它们可使蛋白质变性并对核糖核酸酶有抑制作用，另外液，它们可使蛋白质变性并对核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有机相和水相完全分开，减少残留在水相中氯仿比重大可使有机相和水相完全分开，减少残留在水相中的酚。在用的酚。在用酚酚氯仿氯仿抽提核酸提取液时，还需要剧烈振摇，抽提核酸提取液时，
4、还需要剧烈振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，在酚为防止起泡和促使水相与有机相的分离，在酚氯仿抽提液氯仿抽提液中再加上一定量的中再加上一定量的异戊醇异戊醇。3 3、从溶液中析出、从溶液中析出DNADNA 核酸都溶于水，而不溶于有机试剂。利用此核酸都溶于水，而不溶于有机试剂。利用此性质用性质用乙醇乙醇进行沉淀提取。进行沉淀提取。1.1.新鲜鸡肝组织新鲜鸡肝组织 (约约1g1g)，浸于预冷至，浸于预冷至00的的0.14mol0.14molLNaCl-LNaCl-EDTAEDTA中中，洗去其血液，剥去周围的脂肪及结缔组织。，洗去其血液，剥去周围的脂肪及结缔组织。2.2.将组织剪碎，转入玻璃匀浆
5、器中，加入将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0 01414 mol molLNaCl-LNaCl-EDTAEDTA液液7 ml7 ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。3.3.离心，离心，2500r2500rminmin，15 min15 min。弃上层液体，向沉淀中再加。弃上层液体，向沉淀中再加0 014 mol14 molL-EDTAL-EDTA液混匀，离心洗涤之液混匀，离心洗涤之(如欲获取掺杂如欲获取掺杂RNARNA较少较少的纯的纯DNADNA时，此步离心洗涤应重复多次时，此步离心洗涤应重复多次)。4 4经洗涤后的沉淀，加入经洗涤后的沉淀，加
6、入3 m1 0.14 mol3 m1 0.14 molLNaCl-EDTALNaCl-EDTA，在搅，在搅拌下缓缓滴人拌下缓缓滴人25%25%SDS 0.4mlSDS 0.4ml，转入匀浆器内匀浆，使沉淀悬，转入匀浆器内匀浆，使沉淀悬浮均匀，再加入浮均匀，再加入2mol2molLNaCl 4m1LNaCl 4m1，这时由于大分子脱氧核糖，这时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次，使之均匀。核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次，使之均匀。二、实验步骤（鸡肝）二、实验步骤（鸡肝）5 5加等体积的加等体积的氯仿氯仿异戊醇异戊醇8 m18 m1，剧烈振摇，剧烈振摇10 m
7、in10 min。将。将此混合液离心此混合液离心10000r10000rminmin，3min3min。上层为水液，下层为。上层为水液，下层为氯仿，变性蛋白质在氯仿与水层的界面上。氯仿，变性蛋白质在氯仿与水层的界面上。吸出上层水液吸出上层水液(如欲获取掺杂蛋白质较少的如欲获取掺杂蛋白质较少的DNADNA，此氯仿振摇、离心的操，此氯仿振摇、离心的操作可重复多次，直至界面完全见不到变性蛋白层为止作可重复多次，直至界面完全见不到变性蛋白层为止)。氯仿层液体不要废弃，可倒人收集瓶内，以便蒸馏回收再氯仿层液体不要废弃，可倒人收集瓶内，以便蒸馏回收再用。用。6 6上层水液边摇边加入等体积上层水液边摇边加入
8、等体积9595乙醇乙醇，即可见有长纤，即可见有长纤维线状维线状DNADNA析出，用玻棒朝同一方向搅之，析出，用玻棒朝同一方向搅之，DNADNA纤维即粘缠纤维即粘缠在玻璃棒上，在玻璃壁上尽量将水分挤干。在玻璃棒上，在玻璃壁上尽量将水分挤干。7 7缠在玻璃棒上的缠在玻璃棒上的DNADNA纤维溶于纤维溶于1 m1 TE1 m1 TE缓冲液中留作定缓冲液中留作定量、电泳用。量、电泳用。一、本次实验鸡血一、本次实验鸡血 鱼白鱼白DNADNA粗提粗提的原理：的原理：（一（一)DNA)DNA的粗提的粗提1 1细胞在低渗溶液中吸收水分，出现细胞破裂。细胞在低渗溶液中吸收水分，出现细胞破裂。2 2DNADNA不
9、溶于酒精，溶于浓度较高的盐溶液中，且随浓度的不溶于酒精，溶于浓度较高的盐溶液中，且随浓度的降低溶解度降低。降低溶解度降低。但细胞中某些物质但细胞中某些物质(蛋白质蛋白质)可以溶于酒精溶可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的液，据此可提取杂质较少的DNADNA（二（二)DNA)DNA的鉴定的鉴定DNADNA中的脱氧核糖遇酸生成中的脱氧核糖遇酸生成一羟基一羟基酮基戊醛，再与二苯胺酮基戊醛，再与二苯胺作用显示蓝色。蓝色的深浅与溶液中的作用显示蓝色。蓝色的深浅与溶液中的DNADNA含量成正相关。含量成正相关。二、二、实验步骤实验步骤（鸡血鸡血）1 1、制备鸡血细胞液。取质量浓度为制备鸡血细胞液。取质量
10、浓度为0.1g/ml0.1g/ml的柠檬酸钠的柠檬酸钠（防止血液凝固防止血液凝固）溶液）溶液100ml100ml和新鲜鸡血和新鲜鸡血180ml180ml，注入，注入500ml500ml烧杯中，充分搅拌。将混合均匀的鸡血细胞液置烧杯中，充分搅拌。将混合均匀的鸡血细胞液置于于4 4冰箱内，静置冰箱内，静置2424小时，使血细胞沉淀。弃去上清小时，使血细胞沉淀。弃去上清液，留取下层的细胞液。（液，留取下层的细胞液。（此步骤如果有离心设备，可直此步骤如果有离心设备，可直接离心后得到所需要的血细胞液。转速选用接离心后得到所需要的血细胞液。转速选用20002000转转/分。分。）此步骤已完成此步骤已完成2
11、 2、取出准备好的鸡血细胞液取出准备好的鸡血细胞液5 510ml10ml注入到注入到50ml50ml的烧杯中，并向烧杯中加的烧杯中，并向烧杯中加入入20ml20ml的蒸馏水，的蒸馏水，快速快速搅拌搅拌5min5min。用垫有纱布的漏斗过滤，取其滤液（。用垫有纱布的漏斗过滤，取其滤液（或或者者40004000转转离心离心2 2分钟分钟）。）。（溶胀细胞，释放（溶胀细胞，释放DNPDNP）3 3、取物质的量浓度为取物质的量浓度为2mol/L2mol/L的氯化钠溶液的氯化钠溶液40ml40ml加入滤液中，用玻璃棒沿加入滤液中，用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，使其混合均匀。一个方向轻轻搅拌，使其混合均匀。
12、（解聚（解聚DNADNA和蛋白质？）和蛋白质？）4 4、取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻地、取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻地搅拌。观察烧杯中有无丝状物出现。当丝状物不再增加时，停止加入蒸馏搅拌。观察烧杯中有无丝状物出现。当丝状物不再增加时，停止加入蒸馏水。水。(低盐析出低盐析出DNA)DNA)5 5、用玻璃棒将丝状物挑起，这就是含一定杂质的、用玻璃棒将丝状物挑起，这就是含一定杂质的DNADNA。6 6、将丝状物放入盛有物质的量浓度为、将丝状物放入盛有物质的量浓度为2mol/L2mol/L的氯化钠溶液的试管中，用的氯化钠溶液的试管中，用力振荡
13、力振荡1 12min2min，使丝状物尽可能溶解。，使丝状物尽可能溶解。(DNA(DNA再溶解再溶解)7 7、向上述试管中加入等体积二苯胺试剂，振荡均匀，将试管放入沸水中、向上述试管中加入等体积二苯胺试剂，振荡均匀，将试管放入沸水中水浴水浴4 45min5min，观察颜色的变化。，观察颜色的变化。（二苯胺显色）（二苯胺显色）11提取细胞核物质：提取细胞核物质：溶解核内溶解核内DNA：在滤液中加在滤液中加2mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶液并搅拌，使染色质中溶液并搅拌，使染色质中DNADNA 与蛋白质分离，与蛋白质分离，DNADNA充分溶解，充分溶解，过滤过滤过滤过滤(除杂质除杂质除杂
14、质除杂质)析出析出DNA：DNA黏稠物再溶解：黏稠物再溶解：在烧杯中用在烧杯中用2mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA。提取较纯净的提取较纯净的DNA：DNA的鉴定：的鉴定：获取获取DNA：DNA的的NaClNaCl溶液溶液：在上述溶液中缓缓在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，加入蒸馏水，并沿一个方向并沿一个方向轻轻搅拌轻轻搅拌，出现丝状物；出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水当丝状物不在增加时，停止加水（此时（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。玻璃棒缠出或离心获得含玻璃棒缠出或离心获得含DNA的粘稠物的粘稠物离心取上清，含有离心
15、取上清，含有DNA。加入等体积的加入等体积的95%的冷却酒精的冷却酒精，用玻棒沿一个方向，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（溶液中（析出析出）出现乳白色丝状物，用）出现乳白色丝状物，用玻棒玻棒将将丝状物丝状物卷起，卷起，并用滤纸吸取上面的水分。并用滤纸吸取上面的水分。利用细胞吸水破裂，细胞核内物质释放出来，离心取其滤液。利用细胞吸水破裂，细胞核内物质释放出来，离心取其滤液。血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和核膜的破裂。血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和核膜的破裂。将将DNA充分溶解于充分溶解于2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液中，然后中，然后加入等体积的加入等体积的二苯胺试剂
16、二苯胺试剂，混匀沸水中加热，混匀沸水中加热5min5min后后冷却冷却，可发现，可发现DNADNA与试剂与试剂反应使溶液呈反应使溶液呈现蓝色现蓝色。二、实验步骤（二、实验步骤（鱼白鱼白-鲤鱼的精巢）鲤鱼的精巢）（1 1）实验前先将实验前先将20g20g加水加水400ml400ml用家用榨汁机打匀，放用家用榨汁机打匀，放入冰箱中冷藏（可保质周）或冷冻鱼白。（入冰箱中冷藏（可保质周）或冷冻鱼白。（溶胀细胞，溶胀细胞，释放释放DNPDNP，此步骤已完成此步骤已完成）（2 2）溶解：溶解：取鱼白匀浆液取鱼白匀浆液3ml3ml于于100ml100ml烧杯中，取烧杯中，取10ml10ml的的2mol/2m
17、ol/a al l加入烧杯中，用玻璃棒单向搅拌成溶胶状。加入烧杯中，用玻璃棒单向搅拌成溶胶状。（3 3）析出粘稠物析出粘稠物：取：取50mL50mL以上的蒸馏水沿杯壁慢慢注入以上的蒸馏水沿杯壁慢慢注入烧杯中，同时用玻棒单向搅拌，使冻状粘稠物缠在玻棒上。烧杯中，同时用玻棒单向搅拌，使冻状粘稠物缠在玻棒上。（4 4）再溶解：再溶解：倒掉上清液，把粘稠物放入，倒掉上清液，把粘稠物放入，10ml 2mol/10ml 2mol/a al l注入烧杯中，用玻棒充分搅拌，使粘稠物尽量溶解，注入烧杯中，用玻棒充分搅拌，使粘稠物尽量溶解，再离心取上清再离心取上清 (5)(5)提取含杂质少的：提取含杂质少的：取等
18、体积的取等体积的95%95%的冷酒精，沿烧杯的冷酒精，沿烧杯壁慢慢注入上一步的壁慢慢注入上一步的50mL50mL烧杯中，同时用玻棒单向慢慢搅拌，烧杯中，同时用玻棒单向慢慢搅拌，使白色丝状物缠在玻棒上。使白色丝状物缠在玻棒上。（6 6）鉴定：鉴定：丝状物溶解于丝状物溶解于3ml3ml的的2mol/2mol/a al l，用力振荡，用力振荡2min2min，使丝状物尽可能溶解，然后向试管中加入，使丝状物尽可能溶解，然后向试管中加入3ml3ml二苯胺试剂，二苯胺试剂，振荡均匀，将试管放入沸水中水浴振荡均匀，将试管放入沸水中水浴4 45min5min，观察颜色的变化。，观察颜色的变化。关于关于DNAD
19、NA的鉴定的鉴定1 1、电泳鉴定、电泳鉴定2 2、二苯胺鉴定、二苯胺鉴定3 3、甲基绿鉴定：、甲基绿鉴定：取少许丝状物，置玻片中取少许丝状物，置玻片中央，加央，加1 1滴甲基绿溶液，丝状物变成绿色。滴甲基绿溶液，丝状物变成绿色。15植物细胞植物细胞需要先用需要先用洗涤剂洗涤剂（洗发香波、沐浴液、洗洁（洗发香波、沐浴液、洗洁精等）精等）溶解细胞膜。溶解细胞膜。洗涤剂可以瓦解细胞膜洗涤剂可以瓦解细胞膜的原因是：的原因是：洗涤液中含有十二烷基硫酸钠和洗涤液中含有十二烷基硫酸钠和碱，碱，它们可使细胞膜破裂，蛋白它们可使细胞膜破裂，蛋白质变性，使蛋白质与质变性，使蛋白质与DNADNA分离开来。分离开来。
20、利于利于利于利于DNADNADNADNA的释放。的释放。的释放。的释放。动物细胞膜是不用试剂（动物细胞膜是不用试剂（洗涤剂）洗涤剂）破坏的，破坏的，因为动物细胞膜外面没因为动物细胞膜外面没有细胞壁的保护有细胞壁的保护，放在清水中自，放在清水中自然的就会吸水而胀破，释放出其然的就会吸水而胀破，释放出其中的中的DNADNA等物质。等物质。其他植物材料：香蕉、新鲜菜花、蒜黄、菠菜等其他植物材料：香蕉、新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。16方法步骤方法步骤1 1、将、将30g30g香蕉或菜花切碎，放入研钵中。向研香蕉或菜花切碎，放入研钵中。向研钵中加入钵中加入2g2g氯化钠氯化钠，研磨直至成半流体状。，研磨直至
21、成半流体状。3 3、将混合液用两层纱布过滤或离心，向滤液中、将混合液用两层纱布过滤或离心，向滤液中加入加入预冷预冷的的10ml10ml乙醇乙醇溶液，静置，可产生絮状溶液，静置，可产生絮状的的DNADNA。4 4、将、将DNADNA溶于溶于2mol/2mol/a al l中，轻轻搅拌使其中，轻轻搅拌使其溶解。加入等体积二苯胺试剂，振荡均匀，将溶解。加入等体积二苯胺试剂，振荡均匀，将试管放入沸水中水浴试管放入沸水中水浴4 45min5min，观察颜色的变化。，观察颜色的变化。有利于有利于有利于有利于DNADNA的溶解的溶解的溶解的溶解2 2、向研钵中加入、向研钵中加入10ml10ml蒸馏水或凉开水
22、，搅蒸馏水或凉开水，搅拌。然后加入拌。然后加入10ml10ml洗涤剂洗涤剂，轻轻搅拌。，轻轻搅拌。能溶解细胞膜，有利于能溶解细胞膜，有利于能溶解细胞膜，有利于能溶解细胞膜，有利于DNADNA的释放；的释放；的释放；的释放；DNADNADNADNA析出，除去溶于酒精的蛋白质析出，除去溶于酒精的蛋白质析出，除去溶于酒精的蛋白质析出，除去溶于酒精的蛋白质17例题例题1 1：下列图示中能反映：下列图示中能反映DNADNA溶解度溶解度与与NaClNaCl溶液浓度溶液浓度(mol/L)(mol/L)之间的关系的是（之间的关系的是（）C C0.140.14DNADNA溶溶解解度度0.140.140.140.140.140.14DNADNA溶溶解解度度DNADNA溶溶解解度度DNADNA溶溶解解度度A AB BC CD DNaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度