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1、第十章第十章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定4 42 2 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定1 1 概述概述氨基酸的定性测定氨基酸的定性测定4 45 5氨基酸定量测定氨基酸定量测定3 3蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定凯氏定氮法凯氏定氮法主主 要要 内内 容容氨基酸的分离测定氨基酸的分离测定6 61、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。3、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理1、蛋白质的性质和测定意义；、蛋白质的性质和测定意义；2
2、、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。2.重点重点 1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。3.难点难点3.1.基本知识点基本知识点学学 习习 目目 标标第一节第一节 概述概述一、蛋白质的组成一、蛋白质的组成蛋白质是复杂的含氮有机化合物，蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由它由2020多种多种氨基酸氨基酸通过通过酰胺键以一定以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间的方
3、式结合起来，并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是结构。它主要含的元素是C 、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。二、氨基酸二、氨基酸propro是由氨基酸组成的高分子化合是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达物，目前各种氨基酸已达175175种以上，种以上，但是构成但是构成propro的氨基酸主要有的氨基酸主要有2020种。种。赖氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 缬氨酸 天冬酰胺丝氨酸 ProPro的基本组成单位是氨基酸的基本组成单位是氨基酸那什么是氨基酸呢？几种常见的氨基酸几种
4、常见的氨基酸几种常见的氨基酸几种常见的氨基酸这些氨基酸结构上有什么共同点？羧基和氨基羧基和氨基连接在同一连接在同一个碳原子上个碳原子上蛋白质的基石物质：-氨基酸氨基酸的缩合氨基酸的缩合肽键二肽、多肽等二肽、多肽等误食重金属盐，误食重金属盐，可以喝大量牛奶可以喝大量牛奶进行紧急处理，进行紧急处理，WHY?WHY?鸡蛋水煮会发生鸡蛋水煮会发生什么样变化？什么样变化？医用酒精可以消医用酒精可以消毒，福尔马林可毒，福尔马林可以保存动物标本以保存动物标本，WHYWHY？问：蛋白质具有问：蛋白质具有什么样的性质呢？什么样的性质呢？三、蛋白质的性质三、蛋白质的性质 盐析盐析 变性变性小小 结结u 蛋白质的主
5、要组成元素？蛋白质的主要组成元素？ u 天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万；天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万；u 哪些物质中富含蛋白质呢？哪些物质中富含蛋白质呢？ uProPro是食品的重要组成成分，也是生命的基础是食品的重要组成成分，也是生命的基础。人体。人体11%-11%-13%13%的总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，的总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。只是含量及类型不同。测定食品中的蛋白质含量，对合测定食品中的蛋白质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求，掌握食品的营理调配膳食，保证
6、不同人群的营养需求，掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食品加工中食品养价值，合理开发利用食品资源，控制食品加工中食品的品质、质量都具有重要的意义的品质、质量都具有重要的意义。uProPro是食品的最重要质量指标是食品的最重要质量指标。食品营养价值的高低，主食品营养价值的高低，主要看蛋白质的高低。要看蛋白质的高低。四、蛋白质测定的意义四、蛋白质测定的意义u 除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。味及结构等特征上也起着重要的作用。u 蛋白质是微生物发酵中所必需的重要氮源之一。蛋白质是微生物发酵中所必
7、需的重要氮源之一。Eg. Eg. 发酵原料发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影响很大。影响很大。啤酒啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。但对但对酱和酱油酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白质等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白质含量较高的原料；含量较高的原料；至于至于活性干酵母活性干酵母，含氮量则是评价其成品质量的一个，含氮量则是评价其成品质量的一个重要指
8、标，主要是判定活性酵母菌的数量。重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。四、蛋白质测定的意义四、蛋白质测定的意义五、蛋白质的测定方法五、蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分两大类蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率含氮量、肽键和折射率等测等测定蛋白质含量；定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。等测定蛋白质含量。具体测定方法：具体测定方法：凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染
9、料结合反应、酚试剂法双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪国外：红外分析仪氨基酸总量氨基酸总量酸碱滴定法测定；酸碱滴定法测定；各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定 （p116)p116)一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。（色。（5 5 种染料）种染料）二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3 3种方法）种方法）（二）脂蛋白
10、的显色（二）脂蛋白的显色（2 2种方法）种方法）第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 总蛋白质含量； 氨基酸组成； 混合物中的特定蛋白质的含量； 蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量； 非蛋白氮； 蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡)一、含量及测定意义一、含量及测定意义食品种类食品种类 蛋白质的百蛋白质的百分含量分含量食品种类食品种类 蛋白质的蛋白质的百分含量百分含量大米大米(糙米糙米)大米大米(白米白米)小麦粉小麦粉(整粒整粒)玉米粉玉米粉(整粒整粒) 意大利面条意大利面条玉米淀粉玉米淀粉 7.97.113.76.912.80.3大豆大豆(成熟、生）成熟、生）豆豆(腰子状、
11、生腰子状、生) 豆腐豆腐(生、坚硬生、坚硬) 豆腐豆腐(生、普通生、普通) 36.523.615.88.1食品中蛋白质的含量食品中蛋白质的含量 乳制品乳制品 牛乳牛乳(全脂，液体全脂，液体) 牛乳牛乳(脱脂、干脱脂、干) 切达干酪切达干酪 酸奶酸奶(普通的、低脂普通的、低脂)水果和蔬菜水果和蔬菜 苹果苹果(生、带皮生、带皮) 芦笋芦笋(生生) 草莓草莓(生生) 莴苣莴苣(冰、生冰、生) 土豆土豆(整粒、肉和皮整粒、肉和皮) 3.336.224.95.30.22.30.61.02.1肉、家禽、鱼肉、家禽、鱼 牛肉牛肉(颈肉、烤前腿颈肉、烤前腿) 牛肉牛肉(腌制、干牛肉腌制、干牛肉) 鸡鸡(可供煎
12、炸的鸡胸肉可供煎炸的鸡胸肉) 火腿火腿(切片、普通的切片、普通的) 鸡蛋鸡蛋(生、全蛋生、全蛋) 鱼鱼(太平洋鳕鱼太平洋鳕鱼) 鱼鱼(金枪鱼、白色、罐装、金枪鱼、白色、罐装、 油浸、滴干的固体油浸、滴干的固体) 18.529.123.117.612.517.926.5食品中蛋白质的含量食品中蛋白质的含量 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。程控制均具有极其重要的意义
13、。二、蛋白质系数二、蛋白质系数 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.25）称为）称为蛋白质系数蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦荞麦、青豆青豆、鸡蛋等为鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆，大豆及其制品为及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制
14、品为，牛乳及其制品为6.38。一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查。三、蛋白质含量测定常用的方法三、蛋白质含量测定常用的方法凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为年提出，现发展为常量、微量、自动常量、微量、自动定氮仪法定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。，半微量法及改良凯氏法。凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N N总量较为准确、总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是较为广泛。是经典的分析方法之一，也是GB/T GB/T 500
15、9.5-20195009.5-2019食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法。第一法。三、蛋白质含量测定常用的方法三、蛋白质含量测定常用的方法凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N N量，再换算成为量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含蛋白质含量。食品中的含N N物质，除蛋白质中的氮以外，还物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含N N物物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。粗蛋白质。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数对于
16、不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的据可以得到近似的propro的元素组成百分比。的元素组成百分比。元素元素C CH HO ON NS SP P百分比百分比50507 7232316160 03 30 03 3（一）、凯氏定氮法（一）、凯氏定氮法 凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添加量不同，一般采用硫酸铜、二硫酸和盐类添加量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、
17、汞等物质代替硫酸铜。氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。 有些样品中含有难以分解的含有些样品中含有难以分解的含N N化合物，化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，1818小时或更长时间也难以分解，单独用汞化合小时或更长时间也难以分解，单独用汞化合物，在短时间内即可，但它有毒性。物，在短时间内即可，但它有毒性。凯氏定氮法凯氏定氮法常量分析（常量分析（macro analysismacro analysis）：）：对对0.1g0.1g以上的试样进行的分析。以上的试样进行的分
18、析。半微量分析（半微量分析（semimicro analysissemimicro analysis）：）：对对10mg10mg100 mg100 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。GB/T 5413.1-2019 GB/T 5413.1-2019 婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏定氮法定氮法微量分析微量分析（micro analysismicro analysis）：对对1mg11mg110 mg10 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。超微量分析（超微量分析（ultramicro analysisultramicro a
19、nalysis）：）：对对1mg1mg以下的试样进行的分析。以下的试样进行的分析。痕量分析（痕量分析（trace analysistrace analysis）：）：对待测组分的质量分数小于对待测组分的质量分数小于0.01%0.01%的分析。的分析。超痕量分析（超痕量分析（ultratrace analysisultratrace analysis）：）：对待测组分的质量分数小于对待测组分的质量分数小于0.0001%0.0001%的分析。的分析。GB/T 14666-2019GB/T 14666-2019分析化学术语分析化学术语 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质样品与浓硫酸和催化剂一
20、同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据标准酸消耗量可计算出样品中标准酸滴定，根据标准酸消耗量可计算出样品中蛋白质含量。蛋白质含量。凯氏烧瓶凯氏烧瓶500 mL500 mL或或250 mL250 mL 龙科龙科AA凯氏定氮仪凯氏定氮仪扭力天平扭力天平 分析天平分析天平5 5mLmL移液管移液管 温度可以控制的电炉温度可以控制的电炉小漏斗小漏斗 滴定管
21、滴定管250 250 mLmL锥形瓶锥形瓶 玻璃珠玻璃珠 仪仪 器器（GB/T 5009.5-2019GB/T 5009.5-2019食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 仪仪 器器硫酸铜硫酸铜 ( (CuSOCuSO4 45H5H2 2O)O)硫酸钾硫酸钾硫酸硫酸 ( (密度为密度为1.84191.8419g/L)g/L)硼酸溶液硼酸溶液 (20 (20g/L)g/L)氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 (400 (400g/L) g/L) 盐酸标准滴定溶液盐酸标准滴定溶液 c(HCl)=0.0500 mol/L c(HCl)=0.0500 mol/L 或硫酸标准滴定溶或硫酸标准滴定溶
22、液液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500 mol/L)=0.0500 mol/L混合指示液：混合指示液：1 1份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液 (1 (1g/L) g/L) 与与5 5份溴甲酚绿乙醇份溴甲酚绿乙醇溶液溶液(1(1g/L) g/L) ，临用时混合。，临用时混合。( (也可用也可用2 2份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液(1(1g/L)g/L)与与1 1份次甲基蓝乙醇溶液份次甲基蓝乙醇溶液(1(1g/L)g/L)临用时混合临用时混合) )。 试试 剂剂（GB/T 5009.5-2019GB/T 5009.5-2019食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法
23、）第一法）（GB/T 601-2019 GB/T 601-2019 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备标准滴定溶液的制备1 1、配制、配制 按下表的规定量取盐酸，注入按下表的规定量取盐酸，注入1000 mL1000 mL水中，摇匀。水中，摇匀。常用酸碱浓度表常用酸碱浓度表( (市售商品市售商品) ) （GB/T5009.1-2019 GB/T5009.1-2019 食品卫生检验方法食品卫生检验方法 理化部理化部分分 总则总则）盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl) mol/L(HCl) mol/L盐酸的体积盐酸的体积V /mLV /mL1 190900.50.5454
24、50.10.19 9试剂名称试剂名称分子量分子量含量含量/(%)(质量分数质量分数)相对密度相对密度浓度浓度/(mol/L)盐酸盐酸36.536381.18(约约)12(HCl)硝酸硝酸63.0265681.416(HNO3)高氯酸高氯酸100.5701.6712(HClO4)磷酸磷酸98.0851.7015(H3PO4)硫酸硫酸98.196981.84(约约)18(H2SO4)盐酸盐酸标准滴定溶液配制与标定标准滴定溶液配制与标定 c(HCl)=0.0500 mol/Lc(HCl)=0.0500 mol/L2 2、标定、标定 按下表的规定称取于按下表的规定称取于270270300300高温炉中
25、灼烧至恒重的工作基准高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于试剂无水碳酸钠，溶于50 mL50 mL水中，加水中，加1010滴溴甲酚绿滴溴甲酚绿- -甲基红指示液，用配制甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min2 min，冷却后继续滴定至，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。溶液再呈暗红色。同时做空白试验。说明：说明：u 称量工作基准试剂的质量的数值小于等于称量工作基准试剂的质量的数值小于等于0.5 g0.5 g时，按精确至时，按精确至0.01 mg0.01 mg称量称量; ;数值大于数值大于0.
26、5 g0.5 g时，按精确至时，按精确至0.1 mg0.1 mg称量。称量。u 在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在6 68 mL/min8 mL/min。盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl) mol/L(HCl) mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.10.20.2u制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的5%5%范围范围以内。以内。u标准滴定溶液的浓度小于等于标准滴
27、定溶液的浓度小于等于0.02 mol/L0.02 mol/L时，应于临用时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。重新标定。u除另有规定外，标准滴定溶液在常温除另有规定外，标准滴定溶液在常温15152525下保存时下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。现象时，应重新制备。u贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于用，壁厚最薄处不小于0.5 mm
28、0.5 mm。（GB/T 601-2019 GB/T 601-2019 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备）1 1、配制、配制 按下表的规定量取硫酸，缓缓往入按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000 mL1000 mL水中，冷却，摇匀。水中，冷却，摇匀。2 2、标定、标定 按下表的规定称取于按下表的规定称取于270270300 300 高温炉中灼烧至恒重的工作高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于基准试剂无水碳酸钠，溶于50 mL50 mL水中，加水中，加1010滴溴甲酚绿滴溴甲酚绿- -甲基红指示液，甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮
29、沸用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min2 min，冷却后继，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度 c(1/2H2SO4) mol/Lmol/L硫酸的体积硫酸的体积V /mL/mL1 130300.50.515150.10.13 3硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)/ mol/L)/ mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.
30、10.20.2硫酸硫酸标准滴定溶液标准滴定溶液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500 mol/L)=0.0500 mol/L溴甲酚绿甲基红溴甲酚绿甲基红指示液指示液（GB/T 5009.5-2019GB/T 5009.5-2019食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）（GB/T 603-2019 GB/T 603-2019 化学试剂化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的试验方法中所用制剂及制品的制备制备）溶液溶液I I：称取称取0.1g 0.1g 溴甲酚绿，溶于乙醇溴甲酚绿，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释至稀释至100
31、mL100 mL。溶液溶液：称取称取0.2 g0.2 g甲基红，溶于乙醇甲基红，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释至稀释至100 mL100 mL。取取30 mL30 mL溶液溶液I I、10 mL10 mL溶液溶液，混匀。，混匀。凯氏定氮法总反应式：总反应式：2NH2NH2 2（CHCH2 2）2 2COOH + 13HCOOH + 13H2 2SOSO4 4 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4 + 6CO+ 6CO2 2 + 12SO+ 12SO2 2 + 16H+ 16H2 2O O（一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸-98%-98%） 加加硫酸钾硫酸钾
32、 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜硫酸铜 作为催化剂同时作为消化终点指示剂。也可加氧化作为催化剂同时作为消化终点指示剂。也可加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。所以有汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。能，还可以作为碱性反
33、应指示剂。 氧化剂氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。要注意防要注意防止爆沸止爆沸消化液消化液 + 40%+ 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。2NaOH +2NaOH +（NHNH4 4）2 2SOSO4 4 2NH 2NH3 3 + Na+ Na2 2SOSO4 4 + H + H2 2O O蒸馏蒸馏: :一：加入氢氧化一：加入氢氧化钠溶液要过量钠溶液要过量; ;二：要防止样液二：要防止样液中氨气逸出。中氨气逸出。 用用4%4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合
34、指示剂（甲基红指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰兰+ +甲基红。甲基红。指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸）吸收吸收滴定滴定2NH2NH3 3 + 4H+ 4H3 3BOBO3 3 (NH (NH4 4) )2 2B B4 4O O7 7(NH(NH4 4) )2 2B B4 4O O7 7 + 5H+ 5H2 2O + 2HCl 2NHO + 2HCl 2NH4 4Cl + 4HCl + 4H3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H H2 2SOSO4 4 或或 HClHCl标准溶液吸收，再用
35、标准溶液吸收，再用 NaOH NaOH 标标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。凯氏定氮法分析步骤凯氏定氮法分析步骤再次说明再次说明（一）试样处理（一）试样处理 1 1、称样、称样 ( (约相当氮约相当氮30 30 40 mg)40 mg)（1 1）固体试样：）固体试样：0.200.202.00 g2.00 g（2 2）半固体试样）半固体试样：2.002.005.00 g5.00 g（3 3）液体试样：）液体试样：10.0010.0025.00 mL25.00 mL 2 2、消化准备、消化准备 将试样移入洗净、烘干、编号的将试样移入洗净、烘干、编号的10
36、0 mL100 mL或或500 mL500 mL的凯氏烧瓶内的凯氏烧瓶内 ，加入，加入0.2 g0.2 g硫酸硫酸铜，铜，6 g6 g硫酸钾及硫酸钾及20 mL20 mL硫酸，加入硫酸，加入2 2粒粒3 3粒玻璃粒玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以4545角角斜支于有小孔的石棉网上。斜支于有小孔的石棉网上。GB/T 5009.5-2019GB/T 5009.5-2019食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）3 3、消化、消化 将准备好的凯氏烧瓶以将准备好的凯氏烧瓶以4545斜放于温控电炉上（先垫上石斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用
37、微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化待内容物全部炭化, ,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力散尽后升至高温，加强火力, ,并保持瓶内液体微沸并保持瓶内液体微沸, ,（为加快消化速度（为加快消化速度, ,可可分数次加入分数次加入10 mL 30%10 mL 30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）入！）, ,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的经常转动
38、烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，再继续加热再继续加热0.50.51h1h。然后取下并使。然后取下并使之冷却。之冷却。 消消 化化（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。4 4、定容定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20 mL20 mL蒸馏水摇匀蒸馏水摇匀放冷，小心转移到放冷，小心转移到100 mL100 mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入
39、容量瓶中，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，量瓶中，充分摇匀后，静置至室温静置至室温，加水至刻度线定容，混匀备用。，加水至刻度线定容，混匀备用。同样条件下做一试剂同样条件下做一试剂空白试验空白试验。消消 化化蒸蒸 馏馏（二）（二）蒸馏蒸馏1 1、水蒸汽发生器的准备：、水蒸汽发生器的准备：按要求安按要求安装好定氮装置，保证管路密闭不漏气。装好定氮装置，保证管路密闭不漏气。于水蒸气发生瓶内装水至于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加处，加甲甲基红指示剂基红指示剂3滴及滴及35 mL硫酸硫酸，以保，以保持水呈酸性（防
40、止水中含有持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸，加硫酸使成为使成为(NH4)2SO4形式固定下来，蒸馏形式固定下来，蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。蒸气发生瓶内的水。蒸蒸 馏馏2 2、清洗凯氏定氮仪：、清洗凯氏定氮仪：打开进气口，关闭打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸废液出口，接通冷凝水，空蒸5 10 min，冲冼定冲冼定N仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（进气口（注意不要同时关闭所有进气口注意不要同时关闭所有进气口！），！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由
41、样杯加入少量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室入少量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。后，再放排液口，并使其敞开。3 3、吸收液准备：、吸收液准备：在在250 mL锥形瓶中加锥形瓶中加入入10 mL (20 g/L)硼酸溶液和硼酸溶液和13滴混合指滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。插入液面下。4 4、蒸馏准备：、蒸馏准备：准确吸取准确吸取10mL试样处试样处理液理液，由样杯（小漏斗）流入定氮仪内，由样杯（小漏斗）流入定氮仪内室（反应室），并用室（反应室），并用10 mL水冲洗样杯水冲洗样杯（小漏斗）使流入定氮
42、仪内室（反应室（小漏斗）使流入定氮仪内室（反应室内）内）但内室中溶液总体积不超过内室的但内室中溶液总体积不超过内室的2/3 (约约50 mL)，塞紧棒状玻塞，加水至，塞紧棒状玻塞，加水至杯口杯口12cm，以防漏气，关闭排液口，以防漏气，关闭排液口，迅速由碱杯缓缓加入迅速由碱杯缓缓加入10 mL氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液(400 g/L)，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始蒸馏。蒸馏。蒸蒸 馏馏5 5、蒸馏：、蒸馏：关闭排液口，蒸汽进入反应室关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），（内室），NH3通过冷凝管进入接收瓶被硼通过冷凝管进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏酸吸收，蒸馏5 min，移开接
43、收瓶，使冷凝，移开接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏管下端离开液面，再蒸馏1 min，然后，用，然后，用少量水冲冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集少量水冲冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。于硼酸溶液中。 6 6、收尾：、收尾：关闭进气口，停止送气，废液关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。按上述步骤，换下一试样蒸馏。按上述步骤，换下一试样蒸馏。同时准确同时准确吸取吸取1
44、0 mL试剂空白消化液作空白试验。试剂空白消化液作空白试验。蒸蒸 馏馏滴滴 定定 取下接收瓶取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定溶液以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05 mol/L)滴定至滴定至灰色或蓝紫色灰色或蓝紫色为终点。为终点。结果计算结果计算W W蛋白质含量；蛋白质含量；c c盐酸标准液的浓度，盐酸标准液的浓度，mol/Lmol/L；V V1 1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mLmL；V V2 2滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mLmL；m m样品质量，样品质量，g g；M-1/2 NM-1/2 N2 2的摩尔质量，的
45、摩尔质量，14.01 g/mol;14.01 g/mol;F F蛋白质系数蛋白质系数. .)100/(1001000)(21ggFmMcVVW 此法用于各类食品中蛋白质含量此法用于各类食品中蛋白质含量的测定，是国家标准分析方法。的测定，是国家标准分析方法。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制; ;消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免粘消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失的情况下消化不完全而造成氮损失; ;消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应注意
46、不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全其消化完全; ;样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度注意控制热源强度; ;当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入瓶冷却，加入3030过氧化氢过氧化氢
47、 2 23 mL 3 mL 后再继后再继续加热消化续加热消化; ;若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g5 g可按每克试样可按每克试样5 mL5 mL的的比例增加硫酸用量比例增加硫酸用量; ;般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可，但对于含分钟即可，但对于含有特别难以消化的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸有特别难以消化的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较
48、深绿色呈较深绿色; ;蒸馏装置不能漏气蒸馏装置不能漏气; ;蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量; ;蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸1 1分钟后关掉热源，否则可能造成分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。吸收液倒吸。（二）、（二）、 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量由由 50 mL 10 mL,50 mL
49、10 mL,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由 0.1 mol/L 0.01 mol/L ,0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。可用微量滴定管。10-210-2（三）、（三）、 全自动凯氏定氮法全自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、特点：、特点：（1 1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。线加热的消化炉。（2 2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8 8个样品，个样品，3030分钟可消化分钟可消化完毕。完毕。（3 3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动）自动：自动
50、加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，1212分钟分钟完成完成1 1个样。个样。产品名称：产品名称： 凯氏定氮仪凯氏定氮仪 操操 作作 视视 频频微量凯氏定氮法：v.youku/v_show/id_XODIwODI3NDQ0.html?from=y1.2-1-87.3.2-1.1-1-1-1凯氏定氮法 v.youku/v_show/id_XNzExNDIwMzI=.html?from=y1.2-1-103.3.16-1.1-1-1-15（7 m 54 s) 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、传统的凯氏定氮法应用范围广，