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1、十章蛋白质和氨基酸的测十章蛋白质和氨基酸的测定定蛋白质的组成及特性蛋白质的组成及特性蛋白蛋白质质的的组组成成: : 蛋白蛋白质质由很多的由很多的AAAA单单体以体以肽键结肽键结合而成的具有一定空合而成的具有一定空间结构间结构的含的含氮氮有机化合有机化合物，有的含有物，有的含有P P、S S、 CuCu、FeFe、I I等元素，等元素，分子量高达数万数百万。含氮是分子量高达数万数百万。含氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋白质系数：蛋白质系数：一般而言，蛋白质含氮量约为一般而言，蛋白质含氮量约为16%16%，即，即1 1份氮相当于份氮相当于6.256
2、.25份蛋白份蛋白质，此数值（质，此数值（6.256.25）称为蛋白质系数。）称为蛋白质系数。 氨氨基酸的基酸的种类种类: :自然界中已自然界中已经发现经发现的的氨氨基酸基酸约约有有170170多多种种，其中，其中组组成蛋白的成蛋白的氨氨基酸只有基酸只有2222种种（都是（都是 -AA-AA），其中），其中对对人而言的必需人而言的必需氨氨基酸有基酸有8 8种种（犬的必需（犬的必需氨氨基酸有基酸有9 9种种）。）。组组成蛋白的成蛋白的氨氨基酸（基酸（ -AA-AA）的通式）的通式及及AAAA两两性性电电解解质质特性：特性：2DE2-DE: the technique to separate pr
3、oteins in the first dimension according to their isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the second dimension according to their molecular weight, by SDS-PAGE. 2-DE combined with protein identification basing on microsequencing, amino acid composition and Mass spectrometry, provides
4、an invaluable tool for proteomic studies.Step 1 Sample PrepStep 2 First-Dimension (IEF) Separation Step 3 Second-Dimension (SDS-PAGE) Separation Step 4 Protein Detection by Staining /Destaining凯氏定氮法凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量凯氏定氮法是先测定总氮量, , 然后乘以蛋白质换算系数，即可然后乘以蛋白质换算系数，即可得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测得到粗蛋白质含量。可用于所
5、有动、植物食品的蛋白质含量测定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。故结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法由凯氏定氮法由KieldahlKieldahl于于18331833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为标准检验方法。在此主要介绍被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮
6、法的原理及步骤常量凯氏定氮法的原理及步骤。原理原理: : 样品与浓硫酸和催化剂一同加热样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化消化，使蛋白质分解，其中碳，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化硫，样品中的硫，样品中的有机氮转化为氨有机氮转化为氨与与过量的硫酸结合成硫酸铵过量的硫酸结合成硫酸铵; ; 然然后后加碱蒸馏加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含
7、量。 催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化：、消化：NCOC + 浓浓H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、氨化：、氨化： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 3、吸收吸收: 2NH: 2NH3 3 + 4H + 4H3 3BOBO3 3 （NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O O 4 4、滴定：（、滴定：（NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O + 2HCl 2NHO + 2HCl 2NH4 4Cl + 4HCl + 4H3 3BOBO3 3 ( (注注:
8、NCOC, Nitrogen containing organic compounds ): NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、硫酸钾、硫酸钾 及及硫酸铜的作用硫酸铜的作用2 2、火候控制、火候控制3 3、装置的气、装置的气密性密性4 4、何时加碱、何时加碱5 5、难消化的、难消化的 对策对策6 6、停止蒸馏、停止蒸馏 说明及注意事项
9、说明及注意事项0: 0: 当浓硫酸的用量为当浓硫酸的用量为30ml30ml时，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠等试剂时，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠等试剂应按比例增加应按比例增加。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消未消化完全而造成氮损失。化完全而造成氮损失。消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。洗下并促进其消化完
10、全。样品中若样品中若含脂肪或糖较多时含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%30%过氧化氢过氧化氢2 23mL3mL后再继后再继续加热消化。续加热消化。若取样量较大，若取样量较大，如干试样超过如干试样超过5g5g，可
11、按每克试样，可按每克试样5mL5mL的比例增加硫酸用量的比例增加硫酸用量（何时会必（何时会必要？）。要？）。一般消化至呈透明后，继续消化一般消化至呈透明后，继续消化30min30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消
12、化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠，此时需再增加氢氧化钠用量。用量。硼酸吸收液的温度不应超过硼酸吸收液的温度不应超过4040，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于于冷水浴中使冷水浴中使用。用。1111蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min1min后关掉热源，否则可后关掉热源，否则可能能造成吸收液倒吸造成吸收液倒吸。 (12)(12)混合指示剂混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色
13、。在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 氨基酸的分析 什么是氨基酸? 氨基酸的分类 氨基酸的化学结构? 氨基酸的两性电解质的特性氨基酸的结构氨基酸的结构氨氨基酸的一般显色反应氨氨基酸的一般显色反应 茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。1. 1. 茚三酮法茚三酮法原理原理: : 氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物. .步骤
14、：步骤：将点有样品的层析滤纸充分除尽溶剂，将点有样品的层析滤纸充分除尽溶剂，用用5g/L5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，6565,30min30min（空气中的氨可使背景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。（空气中的氨可使背景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：用用0.4g0.4g茚三酮，茚三酮，10g10g酚和酚和90g90g正丁醇的混合液显色。正丁醇的混合液显色。用用1g/L1g/L茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1
15、min (HOW ?)1min (HOW ?)。为了使显色稳定，可用下列方法：为了使显色稳定，可用下列方法： ( (何谓贮存液及工作液何谓贮存液及工作液? ?) )贮存液贮存液A A：醋酸镉：醋酸镉2g2g、冰醋酸、冰醋酸40mL40mL、蒸馏水、蒸馏水200mL 200mL 贮存液贮存液B B：茚三酮：茚三酮2g2g、丙酮、丙酮200mL200mL显色液：显色液：A/B=1.2:1 (A/B=1.2:1 (按需制备按需制备) )点有样品的滤纸上点有样品的滤纸上浸有浸有此显色液后，放置于盛有一小杯此显色液后，放置于盛有一小杯浓硫酸浓硫酸的密闭玻璃容器中的密闭玻璃容器中2525，18h18h，或
16、较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点也比较稳定。拍照，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点也比较稳定。拍照记录记录! !2 2吲哚醌法吲哚醌法各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。3 3邻苯二甲醛法邻苯二甲醛法邻苯二甲醛在邻苯二甲醛在2-2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发
17、射光波长分别为激发光和发射光波长分别为340nm340nm和455nm。在手提式紫外灯(254/365)254/365)下观察.* 邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量.氨基酸纸上层析灵敏度达氨基酸纸上层析灵敏度达0.50.5moLmoL，在硅胶薄层层析上为，在硅胶薄层层析上为0.050.050.20.2moL (moL (不严密不严密, ,因为各种氨基酸显现的荧光强度不同因为各种氨基酸显现的荧光强度不同, ,所以因指明是什么所以因指明是什么AA.AA.) )* 各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨
18、酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。说明在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以便显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解，氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。个别氨基酸的显色反应个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸可应用于纸层析和纸电
19、泳显色。可应用于纸层析和纸电泳显色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸赖氨酸、羟脯氨酸, ,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、组氨酸。色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、组氨酸。氨基酸定量氨基酸定量一、氨基酸的一般定量测定一、氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH-COOH基和碱性的基和碱性的-NH-NH2 2基。它们相互作用而基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH-NH2 2基与甲基与甲醛结合，从而使其
20、碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴定滴定-COOH-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式如下：反应式如下： 3 3操作方法操作方法 吸取含氨基酸约吸取含氨基酸约20mg20mg的样品溶液于的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL数，供计算总酸含量供计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至
21、pH9.2，记录消耗记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数氢氧化钠标准溶液毫升数(V1)(V1)。同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH82，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V2),(V2),作为试剂空白试验。4结果计算 氨基酸态氮氨基酸态氮质量分数（%）= f(V1-V2)式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗氢氧化钠溶液的体积； V2空白试验加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积5.说
22、明 本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定, , 浑浊和色深样液可不经处理而直接测定浑浊和色深样液可不经处理而直接测定, , 在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。 脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致
23、使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高茚三酮比色法茚三酮比色法 1 1原理原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），该氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm570nm，氨基酸含量氨基酸含量2 2操作方法操作方法(1)(1)标准曲线绘制标准曲线绘制准确吸取相当于准确吸取相当于0 0、100100、200200
24、、300300、400400、500500、600600g g氨基酸氨基酸( (单或混合氨基酸单或混合氨基酸) )标准标准溶液，分别置于溶液，分别置于25mL25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL4.0mL，然后加入茚三酮溶，然后加入茚三酮溶液（液（20g/L20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（）和磷酸盐缓冲溶液（pHpH为为8.048.04）各）各1mL1mL，混合均匀，于水浴上加热，混合均匀，于水浴上加热15min15min，取，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min15min后，在后，在570
25、nm570nm波长下，以试剂空白为参波长下，以试剂空白为参比液比液测定各溶液的测定各溶液的吸光度吸光度A A。绘制标准曲线。绘制标准曲线。(2)(2)样品测定样品测定吸取澄清的样品溶液吸取澄清的样品溶液1 14mL4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A A值，用值，用测得的测得的A A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。3 3结果计算结果计算4 4说明及注意事项说明及注意事项通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5 510g10g或吸取样液样品或吸
26、取样液样品5 510mL10mL，置，置于烧杯中，加入于烧杯中，加入50mL50mL蒸馏水和蒸馏水和5g5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用左右活性炭，加热煮沸，过滤，用303040mL40mL热热水水( (磷酸缓磷酸缓冲液效果如何呢冲液效果如何呢?)?)洗涤活性炭，收集滤液于洗涤活性炭，收集滤液于100mL100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。 茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化行纯化. .茚三酮茚三酮 (四)邻苯二甲醛法(OPT法)1原理邻苯
27、二甲醛邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340和455nm。可能产物为：各种氨基酸显现的荧光强度不同，各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，-赖氨酸，酪氨酸，NH3,半胱氨酸和脯氨酸，。本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高灵敏度较茚三酮法约高100100倍以上，可测到倍以上，可测到0.10.11 110104 4molmol氨基酸。如用于血清中氨基酸。如用于血清中- -氨基氮的测定，每次血清用量只需氨基氮的测定，每次血清用量只需5 51010L L。与另一种荧光
28、试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。CHOCHO+HSCH2OHH2N CHRCOOHCH2+NCRHCOOH SCH2CH2OH二、个别氨基酸的定量测定、个别氨基酸的定量测定（二）色氨酸的测定（二）色氨酸的测定原理原理: :样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（norh
29、armannorharman），具有特征荧光值，），具有特征荧光值，可以进行定量测定。可以进行定量测定。反应式如下：反应式如下：HHCHONCH2CH COOHNH2NCH2CH COOHNCH2NNHCOOH-H,CO2NNHH（一）赖氨酸的测定（一）赖氨酸的测定（二）色氨酸的测定（二）色氨酸的测定（三）苯丙氨酸的测定（三）苯丙氨酸的测定（四）酪氨酸的测定（四）酪氨酸的测定（五）脯氨酸的测定（五）脯氨酸的测定1 1原理原理在丙酮溶剂中，脯氨酸与在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在一定条件下
30、（包括脯氨酸含量，在一定条件下（包括pHpH、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。( (六六) )羟脯氨酸的测定羟脯氨酸的测定 （七）胱氨酸的测定（七）胱氨酸的测定 （八）谷氨酸的测定（八）谷氨酸的测定1 1原理原理L-L-谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶作用下脱羧释放出二氧化碳，由测压法测得二氧作用下脱羧释放出二氧化碳，由测压法测得二氧化碳放出量，计算出谷氨酸含量。化碳放出量，计算出谷氨酸含量。附附 8 8种氨基酸：种氨基酸： 亮氨酸、
31、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 色氨酸、色氨酸、 缬氨酸缬氨酸第七节第七节 氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定一、薄层色谱法一、薄层色谱法1 1原理原理取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的的R Rf f值，不同成分则有不同的值，不同成分则有不同的R Rf f值，因而
32、各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。的深浅可大致确定其含量。D1D1D2D2ABC如何进行如何进行TLCTLC刮样刮样法分离氨基酸法分离氨基酸2D TLC二、氨基酸自动分析仪法二、氨基酸自动分析仪法1 1原理原理氨基酸的组分分析，现在广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。氨基酸的组分分析，现在广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其原理是利用各种氨基
33、酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交其原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pHpH值和离子值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显
34、色，从而定量各种氨基酸。的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物（定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物（570nm570nm）的颜色深浅）的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物（黄棕色化合物（440nm440nm），故需在另外波长处定量测定。，故需在另外波长处定量测定。氨基酸自动分析仪3操作方法 样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析；测定蛋白质的氨
35、基酸组成时样品必须经酸水解（测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解（称取干燥的蛋白质样品数毫克，加入2mL5.7mol/L盐酸，置于110烘箱内水解24h，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀），使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去杂质的方法如下：去糖和淀粉：去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。去脂肪去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。去核酸去核酸：将样品在100g/L氯化钠溶
36、液中，85加热6h，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。去无机盐：去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1mol左右（水解样品干重为0.3mg左右）。测定必须在pH55.5、100下进行，反应进行时间为1015min，生成的紫色物质在570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进行比色测定。* 显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长
37、时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。* 采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的可使蛋白质水解出的1717种氨基酸在种氨基酸在12min12min内内完成分离，完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及一机多用等优点。三、气相色谱法三、气相色谱法1原理将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物三氟乙酰基正丁三氟乙酰基正丁酯。酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAA）的酰化两个步骤。将
38、酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。四、高效液相色谱法四、高效液相色谱法高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常用配置。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。收或荧光检测器进行测定。氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸分析仪，如前文所提的茚三酮反应。此外，如荧光胺（如荧光胺（FluramFluram）、邻苯二
39、甲醛（）、邻苯二甲醛（OPAOPA）也有被人采用。在氨基酸的在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1）固定相采用C18或其它疏水物，可分辨分子结构细小的差异；（2）反相洗脱，流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3）一机多用。 AAs assay by GC1 1原理原理将本身将本身没有挥发性的氨基酸转变没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色为适合于气相色谱分析的衍生物谱分析的衍生物三氟乙酰基氨基酸正丁酯三氟乙酰基氨基酸正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（它
40、包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFATFAA A）的）的酰酰化化两个两个步步骤骤。将酰将酰化好的化好的氨氨基酸衍生基酸衍生物物进进行行气气相色相色谱谱分析。分析。CCRHNH2OOH+C H9OH4OONH3ClHRCC4H9C-+H2O+-C H94CCRHNH3ClOO+(CF3CO)O2C H94CCRHOONHOCCF3HCl1001.1.高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。差的物质和生物活性物质。2. 2. 由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而
41、紫外吸收检测器和荧光检测器是外吸收检测器和荧光检测器是HPLCHPLC仪的最常的检测器。仪的最常的检测器。故人们需将故人们需将氨基酸进行衍生化氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。或荧光检测器进行测定。3.3.氨基酸的衍生可分为氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于额外的反应器和泵，常用于氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪，如前文，如前文所提的茚三酮反应。所提的茚三酮反应。4. 4. 在氨基酸的在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法，测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这
42、是因为比起柱后衍生法它的优点有：（这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1 1）固定相采）固定相采用用C18(C18(反相色谱反相色谱) )，可分辨分子结构细小的差异；（，可分辨分子结构细小的差异；（2 2）流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3 3）一机多用。）一机多用。AAs assay by HPLC蛋白蛋白质营养质营养价的分析方法价的分析方法1、氨基酸组成分析2、必需氨基酸组成及含量分析3、体外酶解分析：蛋白质的可消化性能4、微生物生长分析：检查比需氨基酸及蛋白质的质量5、动物实验法：喂养小鼠。Protein digestibility= N absorbed / N ingestedActual biological value= N retained/ N absorbedCoefficient of protein= N retained / N ingestedTHANKS FOR YOUR ATTENTION！35 结束语结束语