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1、发酵工程在功能性食品中的应用1 功能性食品功能性食品是指强调其成分对人体能充分显示机体防备功能的工业化食品，是新时代对传统食品的深层次要求。开发功能性食品的最终目的，就是要最大限度地满足人类自身的健康需要。开发功能性食品，要对其“安全性”和“功能性”进行科学评判，这就需要明确其中起关键作用的、真正具有生理作用的功效成分，或称活性成分，功能因子。1.1功效成分明显，功效成分是生产功能性食品的关键。就目前而言，业已确认的功效成分，主要包括以下8类： 功能性碳水化合物：如真菌多糖、功能性低聚糖、功能性单双糖。 能性脂类：如-3和-6多不饱和脂肪酸、磷脂等。 氨基酸、肽与蛋白质：如牛磺酸、酪蛋白磷肽、
2、降压肽、免疫球蛋白、酶蛋白等。 维生素和维生素类似物：包括水溶性维生素、油溶性维生素、生物类黄酮等。 矿物元素：包括常量、微量元素等。 植物活性成分：如皂苷、生物碱、萜类化合物、有机硫化物等。 益生菌：主要是乳酸菌类，特别是双歧杆菌。 低能量食品成分：包括蔗糖替代品、脂肪替代品等。 功能性食品的显现，标志着作为食品中的关键组分，开始从重点要求大量的传统营养素，转向重点要求微量的功效成分。1.2高新技术由于功效成分普遍具有“微量” 、“高效”和“不稳固”的特点，应用传统的工程技术，已不能适应微量成分的制造，不能开发出高科技的功能性食品。现代食品工程高新技术的显现，将有力地促进这个问题的圆满解决。
3、高新技术在功能性食品生产中所占的比重不断增大，特别是生物技术的应用得以长足的发展，特别是用在功能性食品配料（即功效成分）的生产上，有力地推动了食品工业革命性的变化。就目前而言，生物技术已在功能性食品生产上得到有效应用，上述的8类功效成分中，除植物活性成分一样采用提取分离法外，其余的均可用生物技术来高效生产。生物技术，是应用自然科学及工程学原理，依靠微生物动物植物细胞及其产生的活性物质，作为某种化学反应的执行者，将原料进行加工成某种产品 来为社会服务的技术。生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程，其中基因工程、 细胞工程和酶工程在功能性食品产业的应用已有相关专著和文献报导，可做参考。以
4、下主要就发酵工程在功能性食品的某些应用作一概述，并简略回忆一下发酵技术的发展历史。2.发酵工程与功能性食品产业2.1发酵技术的沿革 2.1.1传统的微生物发酵技术天然发酵 主要产品有酒、醋、酱油、泡菜、干酪等，特点是发酵过程很难人为控制，生产只能凭体会，口传心授。 2.2.2第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立德国人柯赫第一建立了微生物的纯培养技术，开创了人为控制发酵过程的时期，加上简单密封式发酵罐的发明，发酵治理技术的改进，发酵工业进入了近代化学工业的行列。这时期产品有酒精、丙酮、丁醇、有机酸、酶制剂等，主要是一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。2.2.3第二代（近代）微生物发酵技
5、术深层培养技术可分为两个时期，前一时期抗生素工业的发展，以青霉素的生产为代表，形成规模化生产，同时采用了深层培养技术，即机械搅拌通气技术，从而推动了抗生素工业乃至整个发酵工业的快速发展。这时期的产品主要是好氧发酵的次级代谢产物。后一时期是20世纪50年代氨基酸发酵工业，在引进了“代谢控制发酵技术”后，得以快速发展，即将微生物通过人工诱变，获得代谢发生改变的突变株，在控制条件下，挑选性地大量生产某种人们所需要的产品。这项技术也被用于核苷酸、有机酸和抗生素的生产中。这个时期是近代发酵工业的鼎盛时代。新产品、新技术、新工艺、新设备不断显现，应用范畴也日益扩大，如能源开发、环境保护等。2.2.4第三代
6、微生物发酵技术发酵工程又称微生物工程，以基因工程、细胞工程、蛋白质工程等现代生物技术为支撑，利用微生物的生长和代谢活动，通过现代化工程技术手段进行工业规模生产的技术，是微生物（菌种）、发酵工艺和发酵设备的和谐，根据发酵目的对微生物的采集、分离和选育提出要求，对发酵工艺进行设计和优化，对发酵设备提出改进和配套选型的工程技术。它的主要内容包括：工业生产菌种的选育，最佳发酵条件的挑选和控制，生化反应器的设计以及产品的分离提取和精制等过程。在功能性食品领域，发酵工程在生产多元糖醇、大型真菌菌丝体、微藻、维生素和维生素类似物、多不饱和脂肪酸、功能性乳制品等方面都已到实际应用，并已产生明显的经济效益和深远
7、的社会效益。2.2木糖醇的发酵法生产木糖醇为多元糖醇，溶于水会吸热，其吸热值在糖醇类甜味剂中最大，因此食用时会产生凉快的口感，在体内代谢不需要胰岛素参与，能防龋齿，也可作为非肠道营养的能量来源。 木糖醇的生产方法有三种：提取、化学合成、生物合成。目前，工业生产主要采用化学合成法：半纤维素加酸催化水解，得到含木糖的水解液，经纯化脱色，在一定条件下通过戊糖加氢反应生产木糖醇，转化率5060。生物合成法是利用微生物中的还原酶，以木糖为底物来生产木糖醇，可有效降低木糖醇的生产成本：不仅省去木糖纯化步骤，而且简化木糖醇的分离步骤，是一种很有前途的生产方法。 2.2.1原料：主要使用植物半纤维素的水解产物
8、，半纤维素的主要成分是木聚糖，在无机酸作用下水解成木糖，可作为基质。2.2.2菌种：以木糖为基质生产木糖醇，主要考虑2种酶：一是木糖还原酶（以NADPH或NADH为辅酶），一是木糖醇脱氢酶（以NAD+或NADP+为辅酶）。挑选木糖醇生产菌种的原则：高木糖还原酶活性或低木糖醇脱氢酶活性。根据该原则，挑选了膜醭假丝酵母，木糖代谢途径：木糖 NADPH NADP+木糖醇NAD+ NADH 木酮糖 5磷酸木酮糖 单磷酸己糖途径 2.2.3影响因素 2.2.3.1通气率 通气培养能提高木糖向木糖醇的转化量，因为木糖醇的生产直接同生物量的增加相联系。并且受氧气消耗量的影响极大。要有效生产木糖醇，第一考虑的
9、是微生物细胞在培养基中快速积存，这可通过在介质中溶解氧来解决，但木糖醇的生产需要缺氧条件，在整个培养过程中介质坚持高水平的溶解氧会导致木糖醇氧化成木酮糖。因此，应在培养早期坚持高水平的溶解氧，然后在产木糖醇的时期降低微生物的呼吸率。 2.2.3.2木糖含量 培养基中的木糖含量会显著影响木糖醇的产量。一样来讲，在批量处理中，如果微生物能够耐受高含量的糖分和高渗透压，初始糖含量的增加能提高生产速率和转化率。根据试验初始木糖含量在80g120gL比较合适。 2.2.3.3氮源 氮源和通气率都是非常重要，通过比较8种无机氮源和4种有机氮源，发觉铵盐是最好的无机氮源，酵母提取物是最好的有机氮源。使用这两
10、种氮源时，木糖醇转化率分别为16.7gL和30.6gL 。 2.2.3.4培养基中的其它糖类 往基质中加入葡萄糖，会对酵母发酵木糖生成木糖醇产生反作用，葡萄糖对木糖消耗的禁阻效应，只需很短时间就就能达到最大值，一旦葡萄糖含量降低到一定值时，对木糖的转化很快又重新开始。这说明其调剂机制并不是代谢产物阻遏（阻遏酶合成），而是反馈抑制（抑制酶活性）。当葡萄糖含量低于5gL时，木糖醇的产量不会降低，因为此时葡萄糖进行的是有氧代谢，不会产生乙醇。而当葡萄糖含量超过5gL时，多于部分会通过无氧代谢生成乙醇，此反应和木糖还原生成木糖醇同为还原反应，相互之间竞争氧化还原势，导致木糖醇产量降低。2.2.3.5
11、pH和温度 假丝酵母菌株最适pH46，最适温度范畴2830。2.2大型真菌的发酵法生产许多大型真菌含有多种活性物质，如多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、维生素、植物激素等。具有提高免疫力、抗肿瘤、抗炎和抗溃疡等功效。 大型真菌的深层发酵是在抗菌素发酵技术的基础上发展起来的，与传统栽培真菌子实体的方法不同。它是在大型发酵罐内进行，通过调整培养基组成和发酵工艺，在短时间内得到大量的真菌菌丝体。分析表明，这样得到的真菌菌丝体与传统栽培真菌子实体，在化学组成和生理功能上均很相似。用发酵菌丝体中的真菌多糖、真菌蛋白及其他活性物质，来调制生产功能性食品，这类食品具有增强机体免疫力和明显
12、的抗肿瘤活性，很有发展前途。这种方法的最大优点是，易于实现工业化生产，规模大、产量高、周期短、效益高。缺点是，一次性投资大，部分菌丝体缺乏子实体特有的风味。经研究认为适合于深层发酵的食用或药用大型真菌多达80余种，但真正实现工业化生产的尚不太多。发酵法生产真菌的主要工艺是：母种 摇瓶培养 种子罐 发酵罐深层发酵。 2.2.1灵芝的发酵法生产 2.2.1.1 工艺 斜面母种（2628，5d） 一级摇瓶培养（500ml，2426，200rmin，23d） 二级摇瓶培养（500ml, 2628,90r min,2d) 种子罐培养（40L，2628,，200rmin,1:0.30.5VVm,接种量5%
13、,4d） 发酵罐培养（200L，2628，200r/min，1:0.5VVm，67d） 放罐 2.2.1.2 培养基组成（略） 2.2.1.3 培养条件 温度 灵芝深层培养适宜温度为2730，低于27菌丝生长缓慢，高于30菌丝易老化，3638菌丝停止生长。温度能影响多糖的产量。在发酵过程中，前期030h以稍高的温度促进菌丝迅速生长，在30150h以稍低的温度尽可能延长有效物质的生成期，150h后，温度稍提高，以促进有效物质的分泌。 通气 通气的目的是保证最好的溶氧性，以提供灵芝菌丝体生长所需的氧，此外还可除去二氧化碳和代谢产物。深层培养供氧状况对菌体的生长和有效物质的积存意义重大，特别是发酵初
14、期1216h，由于菌丝量显著增加，菌丝耗氧率达到高峰，对溶解氧极为敏锐，需特别注意供氧状况，否则引起非常发酵，显现菌丝自溶或原生质凝集，导致明显的代谢变化、产量下降甚至发酵失败。 搅拌 由于氧难溶于水，为加大其溶解度，必须进行搅拌，转速100200r/min，过快会把菌丝打得很碎，对菌体生长不利。还应根据培养基得性质，决定搅拌器形式，搅拌流型等问题，灵芝菌丝体深层培养基粘度大液面高，常采用两档或三档搅拌器，大型发酵罐多至四档。目前国内外已发展瘦长型无机械搅拌发酵罐（H:D=1216）,罐身高，空气量大，氧利用率高。由于无机械搅拌，罐体易保持严密，染菌率低，一样在0.2%以下。消泡 灵芝深层培养
15、基中含有蛋白质类物质，在通气和搅拌下易形成泡沫，导致培养液上升，造成大量的逃液，增加染菌机会。同时由于泡沫过多，还会影响通气和搅拌的正常进行。泡沫产生的主要原因有两点：一是通气搅拌程度；二是培养基的原料性质。排除泡沫的方法有机械消泡和消泡剂消泡两种，一样采用后一种。灵芝深层培养的消泡剂为植物油，用量0.03%。pH 灵芝深层培养要求一定的pH范畴，最适生长的pH5.06.0，发酵初期pH4.05.4，到了发酵中期菌丝体生长旺盛，菌体干物质和有效成分积存，pH急剧下降到2.53.5之间，进入发酵后期菌丝生长缓慢，显现菌体自溶，pH回升。发酵过程中pH的变化也与培养基组成有密切的关系，如采用玉米粉
16、蔗糖酵母粉培养基，到发酵中后期pH会急剧下降，而采用花生饼粉蔗糖培养基pH变化不大。在发酵中遇到急剧下降或上升，一样加入酸或碱调剂，加入磷酸盐作缓冲。菌龄与接种量 灵芝深层培养菌种的菌龄一样为48h左右,接种量510，接种量少了会延长发酵周期，接种量太多菌丝老化快，降低有效物质的积存，也给后处理带来困难。2.3维生素C的发酵法生产维生素C，又名L抗坏血酸，为人体所必需的维生素，并作为许多具有重要生理功能的金属酶的辅助因子，参与胶原蛋白的羟基化、肉碱生物合成、多巴胺羟基化等多种代谢活动。同时维生素C还是一种重要的自由基清除剂，可清除超氧阴离子（O2）、羟自由基（OH）和烷过氧基（ROO）等，这些
17、自由基被认为与癌症、心血管疾病等密切相关。维生素C广泛用于食品、功能性食品、药品和化妆品中，目前世界总产量每年近80000t，总值超过6亿美元，市场前景广阔。2.3.1莱氏法工艺一直为生产维生素C的普遍方法，其基本原理是： D葡萄糖 H2/Ni D山梨醇弱氧化醋酸杆菌L山梨糖丙酮/H2SO4双丙酮L山梨糖高锰酸钾双丙酮L古洛酸 水解 2酮基L古洛酸 内酯化、烯醇化 L抗坏血酸2.3.2两次发酵工艺 由于莱氏工艺路线纷杂冗长，辅助原料消耗量大，自20世纪60年代开始研究重点集中于微生物发酵，期望能将D山梨醇或L山梨糖直接转化为2酮基L古洛酸。我国从1969年开始在微生物发酵化学合成法的基础上进行
18、维生素C的两次发酵工艺的研究，在1974年取得很大成功，挑选得到以氧化葡萄糖酸杆菌为主要产酸菌，以条纹假单胞菌为伴生菌的自然共生菌丝，两者共生发酵时，能L山梨糖直接转化为2酮基L古洛酸, 省去了莱氏法中的丙酮保护步骤，避免了丙酮、酸、碱或苯等有机溶剂的大量使用，其工艺简单，可节省大量化工原料，安全卫生，三废和污染较小，已为国内大部分厂家采用。 2.3.3生产菌种将D山梨醇转化为L山梨糖的微生物除弱氧化醋酸杆菌，还可用生黑醋酸杆菌。将L山梨糖转化为2酮基L古洛酸所用的主要产酸菌是氧化葡萄糖酸杆菌，除与条纹假单胞菌共生发酵外，还可与荧光假单胞菌、双黄假单胞杆菌和绿叶假单胞菌等共生发酵。2.3.4发
19、酵工艺 生产时可直接用葡萄糖或淀粉水解液为原料，经还原葡萄糖成山梨醇。反应终止后，过滤除去催化剂，离子交换除去离子杂质，活性炭脱色，浓缩得到符合要求的山梨醇溶液、将山梨醇溶液泵入内循环气升式发酵罐中。加水调剂山梨醇含量至1035，通常在发酵初期浓度较低，待菌体繁育至对数期再提高含量。接种弱氧化醋酸杆菌进行发酵，调pH6.26.8，温度2830，罐内压力0.020.1MPa，通气量0.61vvm，罐内装填率7080。经1430h发酵终止，山梨醇得率可达96.5%，培养基组成（略）。第一次发酵终止后，将发酵醪升温至80保持10min灭菌，补充所需原辅料，调pH6.77.0，接种氧化葡萄糖酸杆菌和条
20、纹假单胞菌，在30温度下进行共生发酵。为保证产酸的正常进行应定期补充碱坚持pH7.0。经2036h，将山梨糖耗尽，发酵达到终点。发酵终止后，过滤或离心除去菌体蛋白，发酵液经静置、澄清、离子交换、浓缩、干燥后可得2酮基L古洛糖酸晶体，再经后续的化学合成阶段得到终产品维生素C，总得率为44.5%46.7%。共生发酵种子和发酵罐培养基（略）2.3.5发酵法生产维生素C的研究进展 2酮基L古洛糖酸转化率的提高 L山梨糖生物氧化成2酮基L古洛糖酸是由细胞膜界面或细胞内的山梨糖酮脱氢酶所催化，生成L山梨糖酮中间体，进入细胞质，然后经胞内脱氢酶进一步作用，在细胞质山梨糖酮还原酶和山梨糖还原酶作用下生成木酮糖
21、，进入磷酸戊糖途径，生成6磷酸葡萄糖，进入糖醛酸途径，生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP葡萄糖醛酸），再经糖醛酸还原酶催化,NADPH为氢供体还原成L古洛糖酸，然后由内酯酶催化脱水形成L古洛糖酸内酯，最后由L古洛糖酸内酯氧化酶氧化成抗坏血酸。灵长目动物和人因为缺乏L古洛糖酸内酯氧化酶，故不能合成抗坏血酸，而大多数动植物都具有这一途径。在这一途径中， UDP-葡萄糖醛酸在差向异构酶催化下，C5上的基团差向异构，生成UDP-艾杜糖醛酸。国外有研究将李氏醋杆菌细胞膜界面上的山梨糖酮脱氢酶基因，在含细胞质山梨糖酮脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌中表达，使L山梨糖氧化为2酮基L古洛糖酸的转化率提高35。 在发酵过
22、程中，由于UDP-艾杜糖醛酸的生成，导致2酮基L古洛糖酸的产量下降。通过化学诱变，可使UDP-艾杜糖醛酸的合成数量大幅度减少，从而提高2酮基L古洛糖酸的得率。另外，也有人提出通过2,5二酮基D葡萄糖酸途径，来合成2酮基L古洛糖酸。先由欧文氏菌突变株将D葡萄糖转化为2,5二酮基D葡萄糖酸，然后将整个培养基经十二烷基硫酸钠处理以降低细胞活力，再加入葡萄糖，最后经棒状杆菌变异菌株作用生成2酮基L古洛糖酸。在整个生产过程中，葡萄糖转化率最高可达85， 2酮基L古洛糖酸的最终含量为10.5g/L。由2酮基L古洛糖酸生物转化为L抗坏血酸 传统工艺中， 2酮基L古洛糖酸可通过两条化学途径转化为L抗坏血酸：一
23、是2酮基L古洛糖酸在强酸下酯化成甲基2酮基L古洛糖酸，然后与碱反应生成抗坏血酸金属盐，最后酸化为抗坏血酸。此法反应步骤较多，且需要使用较多的气态HCL。二是采用一步法，将2酮基L古洛糖酸直接转化为L抗坏血酸，但需要非常昂贵的处理装置和特别的纯化步骤。故两种方法均不理想。目前正在尝试通过生物技术来绕过这些问题。有人研究用水解酶催化2酮基L古洛糖酸生成L抗坏血酸，并申请了专利。另外，也有报道已经分离了能够直接将2酮基L古洛糖酸生成L抗坏血酸的酵母。2.4多不饱和脂肪酸的发酵法多不饱和脂肪酸是指含有二个或二个以上双键且碳原子数为1622的直链脂肪酸。根据其距离脂肪酸中性末端（端）的第一个双键位置，可
24、分为3和 6系列。 3系列主要包括EPA（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）等， 6主要包括GLA(-亚麻酸) 、AA(花生四烯酸)等。这些多不饱和脂肪酸，在人和哺乳动物的组织细胞中的一系列酶催化下，转变为前列腺素血栓素及白三烯等重要衍生物，几乎参与所有的细胞代谢活动，具有广泛的生物学效应。采用发酵法来生产多不饱和脂肪酸，具有生长周期短、繁育力强、可集约化大规模生产，不受气候、季节限制，没有一些不好的气味和滋味，可以利用基因工程提高产量等。 2.4.1EPA和DHA的发酵法生产 2.4.1.1菌种 主要是低级真菌中的藻状菌类，如：毛霉目真菌中高山被孢霉在低温条件下可积存占总脂肪酸15%以上EPA。高等植物中不含有超过C18、2-3个双键的PUFA。但在微藻中C20、C22并含4-6个双键的PUFA很多。国外有研究在脂肪酸水平上有亚油酸转变为EPA有3和6两种主要途径。